Il sistema nervoso di Octopus vulgaris come modello di studio della neurogenesi adulta

La neurogenesi adulta è stata evidenziata in organismi che presentano un'elevata complessità strutturale e funzionale del sistema nervoso, quali pesci, anfibi, rettili, uccelli e mammiferi, e, tra gli invertebrati, crostacei decapodi ed insetti. Sia nei vertebrati che negli invertebrati, essa ha luogo in aree che presentano un elevato grado di plasticità strutturale e che svolgono un ruolo fondamentale nell'apprendimento, nella memoria e nell'integrazione di stimoli sensoriali, ciò suggerisce che il processo sia indispensabile per il supporto delle capacità cognitive più avanzate. Octopus vulgaris presenta un sistema nervoso centralizzato con un'organizzazione strutturale e funzionale di tipo gerarchico, capacità cognitive avanzate e complesse abilità comportamentali. Nel presente lavoro sono state riscontrate cellule in proliferazione in aree coinvolte in apprendimento e memoria, e integrazione degli stimoli sensoriali. Tramite esperimenti comportamentali, è stato verificato che un insieme di stimoli sensoriali ed "intellettivi" inducono un aumento della neurogenesi. Infine, dal sistema nervoso di Octopus, è stato isolato un gene, appartenente alla famiglia Elav, che si è rivelato un ottimo marker della neurogenesi adulta

Olfactory organ of Octopus vulgaris: morphology, plasticity, turnover and sensory characterization

The cephalopod olfactory organ was described for the first time in 1844 by von Kölliker, who was attracted to the pair of small pits of ciliated cells on each side of the head, below the eyes close to the mantle edge, in both octopuses and squids. Several functional studies have been conducted on decapods but very little is known about octopods. The morphology of the octopus olfactory system has been studied, but only to a limited extent on post-hatching specimens, and the only paper on adult octopus gives a minimal description of the olfactory organ. Here, we describe the detailed morphology of young male and female Octopus vulgaris olfactory epithelium, and using a combination of classical morphology and 3D reconstruction techniques, we propose a new classification for O. vulgaris olfactory sensory neurons. Furthermore, using specific markers such as olfactory marker protein (OMP) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) we have been able to identify and differentially localize both mature olfactory sensory neurons and olfactory sensory neurons involved in epithelium turnover. Taken together, our data suggest that the O. vulgaris olfactory organ is extremely plastic, capable of changing its shape and also proliferating its cells in older specimens

Role of olfaction in Octopus vulgaris reproduction

The olfactory system in any animal is the primary sensory system that responds to chemical stimuli emanating from a distant source. In aquatic animals "Odours" are molecules in solution that guide them to locate food, partners, nesting sites, and dangers to avoid. Fish, crustaceans and aquatic molluscs possess sensory systems that have anatomical similarities to the olfactory systems of land-based animals. Molluscs are a large group of aquatic and terrestrial animals that rely heavily on chemical communication with a generally dispersed sense of touch and chemical sensitivity. Cephalopods, the smallest class among extant marine molluscs, are predators with high visual capability and well developed vestibular, auditory, and tactile systems. Nevertheless they possess a well developed olfactory organ, but to date almost nothing is known about the mechanisms, functions and modulation of this chemosensory structure in octopods. Cephalopod brains are the largest of all invertebrate brains and across molluscs show the highest degree of centralization. The reproductive behaviour of Octopus vulgaris is under the control of a complex set of signal molecules such as neuropeptides, neurotransmitters and sex steroids that guide the behaviour from the level of individuals in evaluating mates, to stimulating or deterring copulation, to sperm-egg chemical signalling that promotes fertilization. These signals are intercepted by the olfactory organs and integrated in the olfactory lobes in the central nervous system. In this context we propose a model in which the olfactory organ and the olfactory lobe of O. vulgaris could represent the on-off switch between food intake and reproduction

First attempt to measure adult neurogenesis in a lophotrocozoan (Octopus vulgaris) brain using flow-cytometry technique

In the past decades, researchers provided an amount of significant information about the anatomical, molecular and functional mechanisms underlying neurogenesis in the adult brain. Adult neurogenesis consists in proliferation, migration and differentiation of newborn cells that will be functionally integrated into the existing neural circuitry of adult brain. This process plays a crucial role in adaptation to the environmental challenges. It occurs in animals with complex and centralized nervous system exhibiting cognitive capabilities and sophisticated behavioral repertoires, such as mammals, including humans, non-mammals vertebrates and, among invertebrates, it has been demonstrated in ecdisozoan taxa such as insects and crustaceans too. Octopus vulgaris is considered an “advanced invertebrate” for the size of its brain, the largest of any invertebrates. Evolved from the basal molluscan plan of tetraneury and characterized by a hierarchical organization. Octopus central nervous system is located around the esophagus, in a cartilaginous “cranium” between the eyes, and consists in a supra-esophageal and sub-esophageal masses connected to two optic lobes. Octopus shows complex behaviours and unusual cognitive skills, as learning and memory, problem solving, individual personality and capabilities to play. For these reasons, it seems to be the most likely candidate for the neurogenic process among lophotrocozoans. In our previous works, we found cell proliferation in specific areas of octopus brain involved in learning, memory and processing sensory information. Moreover, we demonstrated, using specific markers as PCNA, PARP1 and Oct-elav1 gene, that enriched environment increases proliferation and synaptogenesis. Given that, we developed a protocol for flow-cytometry analysis to measure the proliferative activity in a faster and more reliable manner then the classical immunohistochemistry. Dissociated cells from proliferating areas of octopus brain, vertical frontal system and optic-olfactory lobes were exposed to BrdU and subjected to PI staining and FACS analysis. Bivariate distributions of BrdU content vs DNA content were analyzed and the G1/S subpopulation was determined. Univariate analysis of DNA content was used to determine the percentage of G2/S cells. Using this technique, we accurately quantified the effective number of proliferating cells in each areas, in order to determine the magnitude of the neurogenic process in octopus brain

CONTROLLO MULTIPEPTIDERGICO DELL???OLFATTO IN Octopus vulgaris

L'organo olfattorio di O. vulgaris è presente in due piccole fossette, difficilmente discriminabili, poste ai lati della testa posteriormente e ventralmente agli occhi in prossimità del margine mantellare. L???epitelio olfattivo ricopre il lume della fossetta all???interno della quale vi è una sorta di protuberanza mobile che le conferisce, in sezione, un aspetto a ?? che ne aumenta la superfice funzionale. Un nostro primo studio morfologico su tale organo ci ha consentito di evidenziare le tipologia cellulari presenti in tale tessuto e di compararle alle strutture olfattive già descritte di altri cefalopodi, ma ad oggi sono davvero pochi studi funzionali sull???olfatto di questo taxon e non vi è alcun dato riguardante O. vulgaris. Mediante metodiche di immunoistochimica classica, abbiamo localizzato a livello sia del lobo olfattorio che dell???organo olfattorio una serie di peptidi dal noto ruolo funzionale: GnRH; FMRFammide; NPY; APGWammide; G??-olf; G??-q; OMP; PCNA. Sia per quanto riguarda il GnRH sia per APGWammide cellule immunoreaative sono state osservate nel lopo olfattorio mentre nell???organo olfattorio sono state riscontrate solo fibre e terminazioni sinaptiche che terminano in prossimità sia delle ring cells sia dei neuroni olfattivi sensoriali (NOS). Una diffusa immunoreattività a livello citoplasmatico è stata riscontrata nei NOS sia per FMRFammide sia per NPY, quest???ultimo risulta marcare un numero maggiore di cellule in animali che avevano subito un periodo di starvazione. G??-olf; G??-q; OMP sono tutti peptidi coinvolti nelle reazioni biochimiche relative all???olfatto, materiale immunoreattivo per queste molecole è stato riscontrato in diverse popolazioni di NOS distribuite all???interno dell???epitelio sensoriale. La PCNA, noto marche di proliferazione, ci mostra un continuo rimaneggiamento dell???epitelio olfattivo a partire dalle zone periferiche verso il centro. L???analisi complessiva delle immunoreattività osservate ed il ruolo biologico dei peptidi analizzati, evidenziano una chiara modulazione dell???olfatto sia a livello centrale che periferico, e sottolineano il ruolo convergente che tali molecole hanno avuto nel corso dell???evoluzione

Magnitude Assessment of Adult Neurogenesis in the Octopus vulgaris Brain Using a Flow Cytometry-Based Technique

Adult neurogenesis is widespread among metazoans, it occurs in animals with a network nervous system, as cnidarians, and in animals with a complex and centralized brain, such as mammals, non-mammalian vertebrates, ecdysozoans, and a lophotrochozoan, Octopus vulgaris. Nevertheless, there are important differences among taxa, especially in the number of the regions involved and in cell proliferation rate during the life-cycle. The comparative evaluation of adult neurogenesis among different brain regions is an arduous task to achieve with only stereological techniques. However, in Octopus vulgaris we recently confirmed the presence of active proliferation in the learning-memory centers, multisensory integration centers, and the motor centers of the adult brain. Here, using a flow cytometry technique, we provide a method to quantify the active proliferation in octopus nervous system using a BrdU in vitro administration without exposing the animals to stress or painful injections usually used. This method is in line with the current animal welfare regulations regarding cephalopods, and the flow cytometry-based technique enabled us to measure adult neurogenesis more quickly and reliably than histological techniques, with the additional advantage of processing multiple samples in parallel. Flow cytometry is thus an appropriate technique for measuring and comparing adult neurogenesis in animals that are in a different physiological and/or environmental contexts. A BrdU immunoreactivity distribution, to define the neurogenic areas, and the effective penetration in vitro of the BrdU is also provided

IL SISTEMA NERVOSO DI OCTOPUS VULGARIS COME MODELLO DI STUDIO DELLA NEUROGENESI ADULTA

La neurogenesi adulta è il processo mediante il quale si generano e si differenziano nuove cellule nervose nel sistema nervoso di un organismo adulto. E??? ormai accertato che nel cervello adulto persistono cellule staminali, confinate in nicchie neurogeniche, che supportano la formazione di nuovi circui8 nervosi. Il processo è influenzato da una mol8tudine di faMori intrinseci ed estrinseci, tra i primi ricordiamo ormoni steroidei e faMori di crescita, tra i secondi abbiamo l???apprendimento, l???arricchimento dell???ambiente circostante e gli s8moli sensoriali. La neurogenesi adulta è stata riscontrata in organismi che presentano un???elevata complessità struMurale e funzionale del sistema nervoso, quali pesci, reOli, uccelli e mammiferi, e, tra gli invertebra8, crostacei decapodi ed inseO. Sia nei vertebra8 che negli invertebra8, la neurogenesi adulta si verifica in aree che presentano un elevato grado di plas8cità struMurale e che svolgono un ruolo fondamentale nell'apprendimento, nella memoria e nell???integrazione di s8moli sensoriali, ciò suggerisce che il processo sia indispensabile per il supporto delle capacità cogni8ve più avanzate.Octopus vulgaris presenta un sistema nervoso centralizzato con un???organizzazione struMurale e funzionale gerarchica, capacità cogni8ve avanzate e complesse abilità comportamentali. Inoltre, vi sono diverse corrispondenze funzionali e struMurali tra specifici lobi del cervello di Octopus e specifiche aree del cervello di mammiferi e inseO in cui ha luogo la neurogenesi, quali, rispeOvamente, ippocampo e mushroom bodies. Pertanto, O.vulgaris può essere considerato un oOmo candidato per lo studio della neurogenesi adulta. Gli esemplari u8lizza8 per la sperimentazione appartengono alla specie Octopus vulgaris. Gli esperimen8 sono sta8 effeMua8 indis8ntamente su individui di sesso maschile e femminile, il peso medio dei polpi seleziona8 è circa di 800g. Gli animali sono sta8 stabula8 presso il Dipar8mento di Biologia del Complesso Universitario di Monte Sant???Angelo, in vasche in PVC, alimentate con acqua di mare a circuito chiuso, a temperatura controllata. Sono sta8 quindi profondamente aneste8zza8 aMraverso l???u8lizzo di isoflurano (Polese e Di Cosmo, CIAC 2012) e in seguito soMopos8 a dissezione del cervello, condoMa in condizioni di sterilità. Dal 1° gennaio 2013 i cefalopodi sono soMo tutela della Comunità Europea, e il comitato di bioe8ca dell???Ateneo regolamenta la sperimentazione su Octopus vulgaris. I nostri esperimen8 sono sta8 condoO in conformità con i principi e8ci di Riduzione, Perfezionamento e Sos8tuzione (Russell e Burch, 1992), che consistono nell???u8lizzare qualsiasi approccio che evi8, allievi e riduca al minimo il dolore, reale o potenziale, angoscia e altri effeO nega8vi subi8 in qualsiasi momento durante la vita degli animali coinvol8, o che migliori il loro benessere. I cervelli sono sta8 incuba8 con BromodeossiUridina (BrdU), un intercalante nucleo8dico che si incorpora al DNA in sintesi, in vitro, in accordo con Di Cristo, Paolucci e Di Cosmo (2008). In seguito all???inclusione in paraffina, i tessu8 sono sta8 taglia8 al microtomo in sezioni da 7??m, reidrata8 ed incuba8 con an8corpo an8-BrdU a 4°C per tuMa la noMe. Dopo abbondan8 lavaggi, le sezioni sono state incubate con un an8corpo secondario bio8nilato per 1 h a temperatura ambiente, poi con streptavidina coniugata con perossidasi per 1 h a temperatura ambiente. Infine la reazione è stata rivelata usando la diaminobenzidina (DAB) come cromogeno. Le aree del sistema nervoso che risultano posi8ve all???an8-BrdU sono localizzate nella massa sopraesofagea. In par8colare, si osservano struMure riconducibili a nicchie di cellule in proliferazione che si approfondano nei neuropili dei lobi appartenen8 al sistema verFcale-frontale, sede dell???apprendimento e della memoria. Tali risulta8 confortano l0ipotesi che in Octopus vulgaris abbia luogo il processo della neurogenesi adulta