La phosphorylation de la MTI-MMP : un nouveau processus impliqué dans la progression tumorale

Durant la progression du cancer, les cellules tumorales doivent envahir les tissus afin de se propager dans l'organisme. Pour ce faire, elles sécrètent ou expriment à leur surface des métalloprotéases matricielles, des enzymes capables de dégrader les composants de la matrice extracellulaire. Parmi ces enzymes, la métalloprotéase matricielle de type membranaire 1 (la MTI-MMP) joue un rôle primordial dans la progression tumorale. La MTI-MMP dégrade de nombreux composants de la matrice extracellulaire et des protéines de surface. Grâce à son activité protéolytique, la MTI-MMP joue un rôle important dans les différentes étapes de la progression tumorale. En effet, la MTl-MMP est importante dans l'angiogenèse tumorale, la formation de nouveaux capillaires à partir de vaisseaux pré-existants, car elle permet aux cellules endothéliales d'envahir la matrice extracellulaire. La MTI-MMP est également impliquée dans l'invasion tumorale et la formation de métastases. Bien que l'activité protéolytique de la MTI-MMP soit importante pour ses fonctions, plusieurs études ont démontré la participation de la séquence cytoplasmique de l'enzyme dans la migration et l'invasion tumorales. Toutefois, les mécanismes par lesquels le domaine intracellulaire de la MTI-MMP contribue aux fonctions de l'enzyme n'ont pas encore été élucidés. La présente thèse avait pour objectif principal d'étudier les mécanismes menant à l'implication du domaine cytoplasmique de la MTI-MMP dans la progression tumorale.\ud Le premier objectif des travaux de recherche présentés dans cette thèse était d'identifier et de caractériser la phosphorylation de la MTI-MMP dans sa portion cytoplasmique. Pour ce faire, nous avons utilisé la mutagenèse dirigée afin d'identifier le site de phosphorylation de la MTI-MMP. Nos résultats démontrent que la MTI-MMP est phosphorylée sur son unique résidu tyrosine 573 situé dans la portion intracellulaire de l'enzyme. Cette phosphorylation a été confirmée par l'utilisation d'anticorps reconnaissant spécifiquement les formes phosphorylées de la MTI-MMP. De plus, la phosphorylation de cette enzyme requiert la présence de la kinase Src. La stimulation des cellules tumorales avec un facteur chimioattracteur induit la phosphorylation de la MTI-MMP endogène dans les cellules tumorales et endothéliales. Nous avons également montré que la phosphorylation de la MTI-MMP sur son résidu tyrosine intracellulaire est importante pour la migration des cellules tumorales et endothéliales. Le second objectif de cette thèse était d'étudier l'implication de la phosphorylation de la MTI-MMP dans la prolifération des cellules dans des matrices tridimensionnelles in vitro ainsi que dans la croissance tumorale in vivo. Nous avons constaté que la phosphorylation est importante pour la croissance des cellules tumorales dans des matrices tridimensionnelles alors qu'elle ne l'est pas dans des matrices en deux dimensions. Également, la phosphorylation de la MTI-MMP est nécessaire aux propriétés tumorigènes des cellules tumorales, à savoir la capacité de ces dernières à envahir de denses barrières de collagène fibrillaire et à former des colonies dans l'agar mou. Fait intéressant, nous avons constaté que l'inhibition de la phosphorylation de la MTI-MMP empêche la formation de xénogreffes chez la souris, suggérant que la MTl-MMP phosphorylée joue un rôle essentiel dans les mécanismes menant au développement tumoral. Le troisième objectif de cette thèse était de vérifier si la MTI-MMP phosphorylée était nécessaire pour la progression tumorale au niveau clinique. Nous avons donc étudié des spécimens provenant de biopsies de patients atteints de neuroblastome. Nos résultats ont démontré que la MTI-MMP phosphorylée était exprimée surtout dans les cas de neuroblastome avec un mauvais pronostic, alors que les cas qui avaient un bon pronostic exprimaient peu la MTI-MMP. Ces données indiquent que la phosphorylation de la MTI-MMP pourrait jouer un rôle important dans le développement du neuroblastome. Compte tenu du rôle majeur de la MTI-MMP phosphorylée dans la progression tumorale, le quatrième objectif de ces travaux de recherche était de concevoir une molécule pouvant inhiber la phosphorylation de la MTl-MMP afin de réduire le développement tumoral. Nous avons donc développé l'ACM-14, un peptide correspondant à la séquence cytoplasmique de la MTl-MMP dans laquelle la tyrosine a été remplacée par une phénylalanine et couplé à une séquence perméable aux cellules. Nos résultats démontrent que ACM-14 réduit la phosphorylation de la MTl-MMP et retarde par conséquent la croissance tumorale in vivo. En somme, les travaux présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations quant à l'implication du domaine intracellulaire de la MTI-MMP dans la progression tumorale. Les résultats présentés vont contribuer au développement et à l'élaboration de nouvelles stratégies afin d'inhiber le développement du cancer. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cancer, Invasion tumorale, MTI-MMP, Phosphorylation, Traitement du cancer

Identification of membrane-type 1 matrix metalloproteinase tyrosine phosphorylation in association with neuroblastoma progression

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Neuroblastoma is a pediatric tumor of neural crest cells that is clinically characterized by its variable evolution, from spontaneous regression to malignancy. Despite many advances in neuroblastoma research, 60% of neuroblastoma, which are essentially metastatic cases, are associated with poor clinical outcome due to the lack of effectiveness of current therapeutic strategies. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP, MMP-14), an enzyme involved in several steps in tumor progression, has previously been shown to be associated with poor clinical outcome for neuroblastoma. Based on our recent demonstration that MT1-MMP phosphorylation is involved in the growth of fibrosarcoma tumors, we examined the potential role of phosphorylated MT1-MMP in neuroblastoma progression.</p> <p>Methods</p> <p>Tyrosine phosphorylated MT1-MMP was immunostained on tissue microarray samples from 55 patients with neuroblastoma detected by mass screening (known to be predominantly associated with favourable outcome), and from 234 patients with standard diagnosed neuroblastoma. In addition, the effects of a non phosphorylable version of MT1-MMP on neuroblastoma cell migration and proliferation were investigated within three-dimensional collagen matrices.</p> <p>Results</p> <p>Although there is no correlation between the extent of tyrosine phosphorylation of MT1-MMP (pMT1-MMP) and MYCN amplification or clinical stage, we observed greater phosphorylation of pMT1-MMP in standard neuroblastoma, while it is less evident in neuroblastoma from mass screening samples (P = 0.0006) or in neuroblastoma samples from patients younger than one year (P = 0.0002). <it>In vitro </it>experiments showed that overexpression of a non-phosphorylable version of MT1-MMP reduced MT1-MMP-mediated neuroblastoma cell migration and proliferation within a three-dimensional type I collagen matrix, suggesting a role for the phosphorylated enzyme in the invasive properties of neuroblastoma cells.</p> <p>Conclusion</p> <p>Overall, these results suggest that tyrosine phosphorylated MT1-MMP plays an important role in neuroblastoma progression and that its expression is preferentially observed in tumor specimens from neuroblastoma patients showing poor clinical outcome.</p

Stabilité physicochimique et microbiologique de différents solutés injectables de fabrications magistrales

Objectifs : Afin de répondre aux normes de pratique moderne, comme ceux d’Agrément Canada et de divers autres organismes réglementaires, il faut procéder au retrait des électrolytes concentrés des unités de soins et des diverses cliniques. Devant le manque évident de disponibilités de certains solutés stériles commerciaux, les principaux solutés injectables requis sont fabriqués en lots et leur stabilité est vérifiée conformément à la norme OPQ 2014.01 et aux autres normes applicables. Un des objectifs de la présente étude était de vérifier s’il est possible d’augmenter la date limite d’utilisation de ces solutés grâce à des tests de stérilité et de teneur. Méthode : Plus d’une vingtaine de préparations d’usage courant au Centre hospitalier universitaire Sainte-Justine ont été étudiées pour leur stabilité à long terme. Quatre catégories principales de solutés ont été préparées en lot, soit des solutés dextrosés à des concentrations non commerciales, des solutés phosphorés, des solutés avec des suppléments divers tels que le magnésium et enfin des solutés de lactate commerciaux additionnés de potassium. Le laboratoire de biochimie a reçu un aliquot de chaque sac chaque semaine et analysé la teneur des divers ingrédients. Un test de stérilité a également été effectué en fin d’étude, soit trois mois après la production. Résultats : Aucune variation de concentration de plus de 5 % n’a été constatée, peu importe l’élément de soluté analysé. Les solutés sont stables tant biochimiquement que microbiologiquement pendant trois mois à partir de la date de préparation en milieu stérile, lorsqu’ils sont exécutés dans le secteur fabrication du Département de pharmacie. Conclusion : Moyennant un contrôle tant biochimique que microbiologique de chacun des lots, il est possible de produire divers solutés non commerciaux dont la stabilité à température ambiante est de trois mois et respecte les normes en vigueur, principalement celles de l’Ordre des pharmaciens du Québec. Ce processus simplifie les soins aux patients et est plus sûr, car il évite la manipulation d’électrolytes concentrés aux unités de soins. Abstract Objectives: To meet the standards of practice, such as those of Accreditation Canada and various other regulatory bodies, for concentrated electrolytes that should be removed from care units and different clinics. Because of the lack of availability of certain commercial sterile solutions, a number of injectable solutions frequently prescribed are prepared in batches and tested for stability in accordance with standard OPQ 2014.01 and other applicable standards. One of the objectives of this study was to determine if the expiry date of these solutions can be extended through sterility and concentration testing. Method: More than 20 preparations in common use at the Centre hospitalier universitaire Sainte-Justine were tested for their long-term stability. Four main categories of solutions were prepared in batches: dextrose solutions at noncommercial concentrations, phosphorus solutions, solutions with various supplements, such as magnesium, and, lastly, commercial lactate solutions with added potassium. The biochemistry laboratory received an aliquot from each bag every week and determined the concentration of the various ingredients. In addition, a sterility test was performed at the end of the study, that is, three months after preparation. Result: No variation in concentration greater than 5% was found for any solution ingredient tested. The solutions are stable, both biochemically and microbiologically, for 3 months from the date of preparation in sterile conditions when made in the preparation section of the Pharmacy Department. Conclusion: By doing both biochemical and microbiological testing on each batch, it is possible to prepare various noncommercial solutions that are stable at room temperature for three months. They comply with the current standards of the Ordre des pharmaciens du Québec. This process helps streamline patient care and it is safer for the patient, since it eliminates the handling of concentrated electrolytes in the care units

Expression of CXCR7 and CXCL12 in NB primary tumors, metastases and control tissues.

<p>Control regroups normal adrenal gland and sympathetic ganglion tissues; Median score means average tumor score, as established by semi-quantitative analysis of the immunostaining; p-value (Student’s t-test) refers to primary tumor: ns means not significant, p<0.05 is considered significant, p≤0.01 is considered very significant.</p

Expression of the two CXCL12 receptors in NB cell lines.

<p>(A) Qualitative RT-PCR analyses for <i>CXCR7</i> and <i>CXCR4</i> mRNA expression in a panel of N-, I-and S-type NB cell lines. <i>GAPDH</i> was used as gene of reference. The prostate cancer cell line PC-3 and the breast cancer cell line MCF-7 were used as positive controls for <i>CXCR7</i> expression. (B) Flow cytometry analyses of CXCR7 and CXCR4 cell surface expression in NB cell lines. Percent represents CXCR7-or CXCR4-positive cells. Grey line: cells stained without the primary Ab. Black line: cells stained with anti-CXCR7 or anti-CXCR4. (C) Semi-quantitative real-time PCR analyses of <i>CXCR7</i> mRNA expression level in the IGR-NB8 cell line after 3 days of treatment with either 10 µM RA or BrdU (left panel). Expression levels of <i>CXCR7</i> transcripts were calculated relatively to the level of the housekeeping gene <i>HPRTI</i>. Untreated (unt.) cells and DMSO-treated NB cells represented control conditions. Columns indicate results in triplicates, and were representative of two independent experiments. Error bars indicate S.D. Student’s t-test: *p<0.05, **p<0.01. Images (right panel) represent immunofluoresence staining of β₃-tubulin (red) and DAPI (blue) in treated or untreated IGR-NB8 cells. (D) CXCR7, CXCR4, or a combination of the two CXCL12 receptors was overexpressed in the IGR-NB8 and the SH-SY5Y cell lines. As all vectors encoded for EGFP, transduced GFP-expressing NB cells were sorted by FACS to control transfection efficiency. Both NB8pMigr and SHSYpMigr cell lines represented control cells, transduced with the pMigr empty vector. Percent of CXCR7-and CXCR4-positive transduced cells are indicated as well as the mean fluorescent intensity (brackets) for CXCR7 and CXCR4 staining. Dark and grey lines: cells stained without anti-CXCR7 and anti-CXCR4, respectively; Green and blue lines: cells stained with anti-CXCR7 and anti-CXCR4, respectively. (E) Semi-quantitative real-time PCR analyses for <i>CXCR7</i> mRNA expression levels in NB transduced cell lines. Experiment was performed in triplicates. Error bars indicate S.D.</p

TMA: clinical characteristics.

<p>mo: month.</p><p>n: number of cases.</p><p>INSS: International Neuroblastoma Staging System.</p><p>COG: Children Oncology Group.</p><p>NB: neuroblastoma.</p><p>UnNB: undifferentiated NB.</p><p>GGNB: ganglioneuroblastoma.</p><p>GGN: ganglioneuroma.</p

Impact of CXCR7 on NB growth and migration in vitro.

<p>(A) Clonogenic growth of NB transduced cell lines was evaluated in a soft agar assay, after at least two weeks of incubation at 37°C. Columns: mean values ± SEM of two independent experiments. When stipulated, 100 ng/mL CXCL12 were added to the culture medium. (B) Chemotaxis of transduced NB cells toward 100 ng/ml CXCL12. Columns: mean values ± SEM of at least two independent experiments. Student’s t-test was used for all experiments: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.</p

Impact of CXCR7 on NB growth in vivo.

<p>(A) <i>In vivo</i> tumor take (number of sites with tumor/total sites) and growth (mean tumor volume ± SEM) after <i>s.c</i> implantation of transduced NB cells in nude mice. Two-way ANOVA: **p<0.01. (B) Production of CXCL12 was measured by ELISA in transduced NB cell lines, and derived <i>s.c</i> tumors. Normal nude mouse adrenal gland (AG) tissue was used as positive control. Results are expressed in triplicates as pg of CXCL12 per mg of extracted protein. Error bars indicate S.D. of triplicates. (C) <i>In vivo</i> orthotopic implantation of NB8×4 and NB8×4×7 cell lines in nude mice. Upper panel: tumor take represented as fraction and percentage of tumor-bearing mice from week 3 to week 6 after NB cell implantations. Lower panel: kinetics of tumor volume. Mann-Whitney test: *p<0.05.</p