Breakdown of the Endothelial Barrier Function in Tumor Cell Transmigration

The ability of tumor cells to metastasize is associated with a poor prognosis for cancer. During the process of metastasis, tumor cells circulating in the blood or lymph vessels can adhere to, and potentially transmigrate through, the endothelium and invade the connective tissue. We studied the effectiveness of the endothelium as a barrier against the invasion of 51 tumor cell lines into a three-dimensional collagen matrix. Only nine tumor cell lines showed attenuated invasion in the presence of an endothelial cell monolayer, whereas 17 cell lines became invasive or showed a significantly increased invasion. Endothelial cells cocultured with invasive tumor cells increased chemokine gene expression of IL-8 and Gro-β. Expression of the IL-8 and Gro-β receptor, CXCR2, was upregulated in invasive tumor cells. Addition of IL-8 or Gro-β increased tumor cell invasiveness by more than twofold. Tumor cell variants selected for high CXCR2 expression were fourfold more invasive in the presence of an endothelial cell layer, whereas CXCR2 siRNA knock-down cells were fivefold less invasive. We demonstrate that Gro-β and IL-8 secreted by endothelial cells, together with CXCR2 receptor expression on invasive tumor cells, contribute to the breakdown of the endothelial barrier by enhancing tumor cell force generation and cytoskeletal remodeling dynamics

Über die spontane Bewegung von zytoskeletal gebundenen Markern

The purpose of this thesis is, first, to characterize the spontaneous motion of cytoskeletally bound particles by statistical means, second, to identify its mechanism, and third, to apply the developed methods to pertinent biophysical questions. To analyze the spontaneous bead motion, micron-sized beads are bound to the cytoskeleton of cells, where they serve as markers to follow the ongoing cytoskeletal remodeling. The thesis is organized as follows: In chapter 2, the cell with its most important properties is introduced. The cytoskeleton takes center stage because the spontaneous bead motion is based on the cytoskeletal reorganization processes. In chapter 3, the technique of nanoscale particle tracking and its implementation and realization (hardware as well as software) are described. Limitations due to noise and drift are addressed and a new method for drift correction is presented. In chapter 4, general statistical properties of the spontaneous bead motion are developed and applied. Their importance and what they tell us about cells, especially their cytoskeletal remodeling, are presented and discussed. An interpretation of the spontaneous bead motion is developed in chapter 5. It is demonstrated that the statistical properties of the spontaneous bead motion display similarities to the statistical properties of the deformations of a flexible matrix (polyacrylamid gel) the cells are placed onto. Furthermore, it is shown that the orientation of the stress fiber the bead is attached to determines its motion. Additionally, the cross correlated motion of bead pairs is investigated. These results are compared to a biophysical model based on a network of actomyosin stress fibers the beads are connected to. Interestingly, this model can account for many of the statistical properties of the spontaneous bead motion. Finally, the extend to which the motion of the entire cell body contributes to the spontaneous bead motion on short time scales (minutes) and long time scales (hours) is investigated. In chapter 6, the developed statistical methods are applied to pertinent biophysical questions. First, in section 6.1, the stress fibers are blocked directly and indirectly by pharmacological treatment to study the impact of cytoskeletal stress fibers on the spontaneous bead motion. Next, it is shown that the bead-cytoskeleton connections can be strengthened by mechanical stimulation. A resulting tightened bead coupling as well as reinforced stress fibers acting on the beads affect its motion. These results are discussed in section 6.2. Specific bead coatings induce the formation of a beadcytoskeleton coupling, mediated by integrins or without the participation of integrins. Whether an integrin mediated bead-cytoskeleton link is important for a directed bead motion is addressed in section 6.3. Different bead sizes are investigated in section 6.4. The bead size is assumed to affect the strength of the bead-cytoskeleton link and thus, the spontaneous motion. The temporal development of such bead-cytoskeleton connections (via integrins and without integrins and for two different bead sizes) is studied in section 6.5. The beginning of the bead binding process as well as long bead binding times up to seven hours reveal an interesting insight into the maturation and deactivation of the bead-cytoskeleton connections. In section 6.6, differently metastatic tumor cell lines derived from different tissues are investigated. They are distinguished from each other by upregualtion of certain proteins and by different mechanical properties, for instance stiffness. Thus, some differences as well as similarities in the spontaneous bead motion are expected. Indeed, the spontaneous bead motion was found to correlate with mechanical measurements of cell stiffness and with the invasiveness of the cells. The most important results and their interpretation are summarized and discussed in chapter 7.Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der spontanen Bewegung von Markern, die an das Zytoskelett gebunden sind. Das Zytoskelett besteht aus fadenförmigen, flexiblen Filamenten (z.B. Aktinfilamente und Mikrotubuli), die ein Netzwerk bilden. Aktinfilamente, quervernetzt mit Myosin-Motorproteinen bilden Stressfasern, die für die Krafterzeugung der Zelle verantwortlich sind. Zudem spielt das Zytoskelett eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von weiteren Prozessen in lebenden Zellen, wie z.B. intrazellulärer Transport, Fortbewegung der Zelle, Zellteilung und mechanochemische Signalübertragung. Das Zytoskelett steht unter Spannung und baut sich fortwährend um. Diese dynamischen Umbauprozesse können quantifiziert werden, indem man die spontane Bewegung von mikrometergroßen, an das Zytoskelett gebundenen Markern analysiert. Ziel dieser Arbeit war es, die zytoskeletalen Umbauprozesse mit Hilfe dieser Marker zu charakterisieren, zu interpretieren und für die Beantwortung einer Vielzahl von biophysikalischen Fragen heranzuziehen. Die Dissertation ist wie folgt aufgebaut: In Kapitel 2 wird die Zelle mit ihren wichtigsten Eigenschaften vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf dem Zytoskelett liegt. In Kapitel 3 wird die Methode des Nanoscale Particle Tracking (Hardware und Software Realisierung) beschrieben. Einschränkungen aufgrund von Rauschen und Drifteffekten werden angesprochen und eine neue Methode zur Driftkorrektur wird vorgestellt. In Kapitel 4 werden generelle statistische Techniken entwickelt und auf die spontane Markerbewegung angewendet sowie die Bedeutung dieser Techniken im Hinblick auf das Verständnis der zytoskeletalen Umbauprozesse diskutiert. Eine Interpretation der spontanen Markerbewegung wird in Kapitel 5 entwickelt. Es wird gezeigt, dass die statistischen Eigenschaften der spontanen Markerbewegung Ähnlichkeiten zu den statistischen Eigenschaften der Deformationen einer flexiblen Matrix (Polyacrylamidgel), auf der die Zellen aufgewachsen sind, aufweisen. Zudem wird gezeigt, dass die Orientierung der Stressfasern an denen der Marker anhaftet, seine Bewegung bestimmt. Des Weiteren wird die Kreuzkorrelation eines Markerpaares analysiert. Diese Resultate werden mit einem biophysikalischen Modell verglichen, das auf einem Netzwerk von Actomyosin-Stressfasern, die an die Marker gebunden sind, basiert. Interessanterweise kann dieses Modell viele der statistischen Eigenschaften der spontanen Markerbewegung reproduzieren. Zum Schluss wird der Beitrag der Bewegung des gesamten Zellkörpers zur spontanen Markerbewegung auf kurzen (Minuten) und langen Zeitskalen (Stunden) analysiert. In Kapitel 6 werden die entwickelten statistischen Methoden auf wichtige biophysikalische Fragestellungen angewendet. In Kapitel 6.1 werden Pharmazeutika zur direkten oder indirekten Blockierung der Stressfasern eingesetzt, um die Bedeutung der Stressfasern für die spontane Markerbewegung zu studieren. Zudem wird gezeigt, dass die Marker-Zytoskelett-Verbindungen durch mechanische Kräfte verstärkt werden können. Welchen Einfluss dies auf die spontane Markerbewegung hat, wird in Kapitel 6.2 diskutiert. In Kapitel 6.3 wird untersucht, welchen Einfluss die spezifische Anbindung der Marker an das Zytoskelett über integrin-gesteuerte oder integrin-unabhängige Rezeptoren hat. In Kapitel 6.4 werden unterschiedlich große Marker untersucht. Die zeitliche Entwicklung von Marker-Zytoskelett-Verbindungen (über Integrine oder integrin-unabhängig) wird in Kapitel 6.5 untersucht. Sowohl der Beginn des Anbindungsprozesses des Markers an das Zytoskelett als auch lange Anbindungszeiten werden analysiert. In Kapitel 6.6 wird die spontane Markerbewegung von unterschiedlich metastasierende Tumorzelllinien untersucht und mit weiteren Eigenschaften (wie z.B. die Steifigkeit) in Beziehung gesetzt. Die wichtigsten Ergebnisse und ihre Interpretation werden in Kapitel 7 zusammengefasst