Otimização da extração de ácidos nucleicos de material de punção aspirativa por agulha fina de tiroide obtido de lâminas coradas, tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina e amostras de sangue estocadas por longo período

OBJECTIVE: Adequate isolation of nucleic acids from peripheral blood, fine-needle aspiration cells in stained slides, and fresh and formalin-fixed/paraffin-embedded tissues is crucial to ensure the success of molecular endocrinology techniques, especially when samples are stored for long periods, or when no other samples can be collected from patients who are lost to follow-up. Here, we evaluate several procedures to improve current methodologies for DNA (salting-out) and RNA isolation. MATERIALS AND METHODS: We used proteinase K treatment, heat shock, and other adaptations to increase the amount and quality of the material retrieved from the samples. RESULTS: We successfully isolated DNA and RNA from the samples described above, and this material was suitable for PCR, methylation profiling, real-time PCR and DNA sequencing. CONCLUSION: The techniques herein applied to isolate nucleic acids allowed further reliable molecular analyses. Arq Bras Endocrinol Metab. 2012;56(9):618-26OBJETIVO: O isolamento adequado de ácidos nucleicos a partir de sangue periférico, lâmina corada de punção aspirativa por agulha fina, tecido fixado em formalina e emblocado em parafina e tecido fresco é fundamental para assegurar o sucesso de técnicas aplicadas em endocrinologia molecular, principalmente quando lidamos com amostras estocadas por longos períodos ou quando há impossibilidade de nova coleta de amostra de pacientes que perderam o seguimento. Neste trabalho, objetivamos otimizar as metodologias clássicas para a extração de DNA (salting-out) e RNA. MATERIAIS E MÉTODOS: Utilizamos proteinase K, choque térmico, dentre outras modificações, com o objetivo de aumentar a quantidade e a qualidade do material recuperado a partir das amostras descritas acima. RESULTADOS: Isolamos com sucesso DNA e RNA de tais amostras e o material obtido foi adequado para a realização de PCR, perfil de metilação, PCR em tempo real e sequenciamento de DNA. CONCLUSÃO: As técnicas aplicadas neste estudo para isolar ácidos nucleicos permitiram a realização posterior de análises moleculares consistentes e confiáveis. Arq Bras Endocrinol Metab. 2012;56(9):618-26Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de MedicinaFaculdade de Medicina do ABC Department of Morphology and PhysiologyUNIFESP, EPMSciEL

The absence of mutations in homeobox candidate genes HOXA3, HOXB3, HOXD3 and PITX2 in familial and sporadic thyroid hemiagenesis

Background: the molecular mechanisms leading to the formation of the two thyroid symmetrical lobes, which are impaired in thyroid hemiagenesis (TH), are little known. Objective: the aim of this work was to search for mutations in thyroid developmental candidate genes HOXA3, HOXB3, HOXD3 and PITX2.Methods: Total DNA from peripheral blood was extracted and then the entire coding region of all these genes was amplified by polymerase chain reaction and direct sequencing.Results: Herein we describe familial cases of TH in two generations (proband and his father), in addition to other two sporadic cases. We have found polymorphisms in the HOXB3 (rs2229304), HOXD3 (rs34729309, rs1051929, c. 543199G > T and c. 543-34G > A; and a new synonymous variant, NP_ 008829.3: p. 314; C > G) and PITX2 (c. 45+ 76C > T) genes, but no deleterious mutations.Conclusion: These results suggest the existence of other left-right thyroid asymmetry candidate genes in humans such as classical Mendelian mutation-causing disease, as well as other etiopathogenic mechanisms such as epigenetic modifications, especially for sporadic hemiagenesis.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Universidade Federal de São Paulo, Lab Mol & Translat Endocrinol, BR-04039032 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Lab Mol & Translat Endocrinol, Dept Med, Escola Paulista Med, BR-04039032 São Paulo, BrazilUniv Fed Parana, Dept Pediat, BR-80060000 Curitiba, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Lab Mol & Translat Endocrinol, BR-04039032 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Lab Mol & Translat Endocrinol, Dept Med, Escola Paulista Med, BR-04039032 São Paulo, BrazilFAPESP: 2012/01628-0FAPESP: 2012/02465-8FAPESP: 2011/20747-8FAPESP: 2012/00079-3Web of Scienc

Analysis of somatic mutations in BRAF, CDKN2A/p16 and PI3KCA in patients with medullary thyroid carcinoma

Medullary thyroid carcinoma (MTC), a neuroendocrine tumor originating from thyroid parafollicular cells, has been demonstrated to be associated with mutations in RET, HRAS, KRAS and NRAS. However, the role of other genes involved in the oncogenesis of neural crest tumors remains to be fully investigated in MTC. The current study aimed to investigate the presence of somatic mutations in BRAF, CDKN2A and PI3KCA in MTC, and to investigate the correlation with disease progression. DNA was isolated from paraffin-embedded tumors and blood samples from patients with MTC, and the hotspot somatic mutations were sequenced. A total of 2 novel HRAS mutations, p.Asp33Asn and p.His94Tyr, and polymorphisms within the 3' untranslated region (UTR) of CDKN2A (rs11515 and rs3088440) were identified, however, no mutations were observed in other genes. It was suggested that somatic point mutations in BRAF, CDKN2A and PI3KCA do not participate in the oncogenesis of MTC. Further studies are required in order to clarify the contribution of the polymorphisms identified in the 3' UTR of CDKN2A in MTC.Sao Paulo State Research FoundationUniv Fed Sao Paulo, Dept Med, Escola Paulista Med, Lab Mol & Translat Endocrinol, 669 Rua Pedro Toledo, BR-04039032 Sao Paulo, BrazilUniv Fed Sao Paulo, Escola Paulista Med, Dept Biochem, BR-04039032 Sao Paulo, BrazilUniv Fed Sao Paulo, Escola Paulista Med, Dept Pathol, BR-04039032 Sao Paulo, BrazilUniv Fed Sao Paulo, Dept Med, Escola Paulista Med, Lab Mol & Translat Endocrinol, 669 Rua Pedro Toledo, BR-04039032 Sao Paulo, BrazilUniv Fed Sao Paulo, Escola Paulista Med, Dept Biochem, BR-04039032 Sao Paulo, BrazilUniv Fed Sao Paulo, Escola Paulista Med, Dept Pathol, BR-04039032 Sao Paulo, BrazilFAPESP: 2012/11036-3FAPESP: 2012/02465-8FAPESP: 2012/01628-0FAPESP: 2009/50575-4FAPESP: 2012/00079-3FAPESP: 2011/20747-8Web of Scienc

Pesquisa acadêmico-científica nas instituições de ensino superior: do faz-de-conta à realidade do mundo digital

Neste artigo apresentam-se reflexões sobre o processo de pesquisa acadêmico-científica, tomando-se por base a constatação de que as práticas utilizadas nas instituições de ensino superior geralmente não atendem às demandas da educação e da pós-modernidade. Indica-se a necessidade de se adotarem estratégias de aprendizagem mais eficazes, que permitam que esse processo seja trabalhado, desde os primeiros níveis de formação, favorecendo o diálogo, a cooperação e a interatividade entre os agentes do processo educacional. O pressuposto é de que os professores estejam compromissados em fornecer, aos estudantes, o instrumental básico para que a pesquisa se efetive, em consonância com os desafios do mundo digital, possibilitando-lhes o desenvolvimento de suas potencialidades, a fim de se tornarem artífices de seu próprio conhecimento e aprendizado