USEFULNESS OF AN MULTIPLEX REALTIME PCR FOR DETECTION OF DIFFERENT CAPRINE ARTHITIS VIRUS GENOTYPES

Introduction: A serological survey carried out between 2005 and 2008 by the “Istituto Zooprofilattico Sperimentale” of Sardinia; showed that CAEV infection is spread throughout the regional territory with a prevalence of positive farms around 80% and a seropositivity of more than 70% of tested animals. The CAE is a serious threat to goat-sheep heritage and is likely to compromise an economy that is a fundamental source of income for breeders, especially in those areas considered "agronomically" difficult. It can be inferred therefore that the disease will become more important in the coming years than it has been in the past. Currently, there are no vaccines for the control of the infection, thus the only prophylaxis that can be implemented is hygienic- sanitary. Prevention measures are based on the removal of healthy infected heads. In this context, laboratory testing for CAEV-positive samples plays a crucial role in the entire diagnostic procedure. The aim of the work was to evaluate a molecular system based on real-time PCR amplification on relatively gag gene sequences in the SRLV, as already indicated by several authors [1,2]. Methods: A total of 50 blood samples from farms in southern Sardinia with a clinical diagnosis for CAEV infections have been anlyzed and proviral DNA was obtained from buffy-coat by GeneProof Pathogen Kit (Brno-Czech Republic), 2 μl of DNA extract was used in a real-time PCR reaction by using the kit SYBR Premix (TaKara-Clontech ®) with a LightCycler II Roche® apparatus following the manufacture istructions [3]. The PCR target region was identified by multiple sequence alignment program Geneious Biomatters Ltd., on gag gene sequences available in the DNA data Bank (GenBank). Melting curve analysis showed two different peaks after real time PCR reaction. Positive samples showed a Tm peak ranged from 82 °C to 88 °C, while the negative sample was identified for a unique peak positioned from 73 °C to 77 °C, Figure 1. These samples resulted 90% CAEV positives and the analysis of the melting curve revealed several multiple-infection (different CAEV variants in the same subject), in this case the most detected sequences are referenced to genotypes B3 and E (subtype Volterra, Fonni, Roccaverano, Seui) GenBank accession n. JF502417, JF502416, EU293537, GQ381130 Conclusions: The presented method/approach could be suitable for a rapid and complete laboratory diagnosis of CAEV infection

SISTEMA INTEGRATO RT-PCR SEQUENZIAMENTO PER LA DIAGNOSI DI LABORATORIO PER INFEZIONE DA VIRUS CAEV

SISTEMA INTEGRATO RT-PCR SEQUENZIAMENTO P023 PER LA DIAGNOSI DI LABORATORIO PER INFEZIONE DA VIRUS CAEV M.C. Carassino1, D. Corda1, S. Fais2, G. Orrù2, M. Liciardi1 1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Struttura Complessa di Cagliari 2 Servizio di Biologia Molecolare (MBS) Azienda Ospedaliera Universitaria, Cagliari Introduzione: Il virus dell'artite-encefalite caprina (CAEV) è un retrovirus, appartenente al genere Lentivirus. I lentivirus dei piccoli ruminanti (SRLV) sono un gruppo di virus eterogenei dal punto di vista genetico, antigenico e biologico. Gli SRLV comprendono ad oggi almeno 5 genotipi, indicati con le lettere da A a E; in Italia sono presenti almeno 3 genotipi A(MV-like), B ed E. L'ELISA è il metodo diagnostico più diffuso in quanto consente di avere risultati rapidi e poco costosi. Tuttavia il problema della sieroconversione ritardata da parte dei soggetti infetti rende tali risultati poco significativi nelle prime fasi dell'infezione. Scopo di questo lavoro è quello di mettere a punto una modalità diagnostica molecolare, sensibile e specifica che individui i genotipi virali B ed E, in particolare i ceppi Fonni, Volterra, Seui e Roccaverano [1,2]. Materiali e metodi: Il target per la PCR è stato identificato nella regione del genoma LTR-GAG in una zona con alta percentuale di omologia disegnando una coppia di primers degenerati in grado di identificare i 4 ceppi, amplificando un frammento da 180 a 230 paia di basi. Gli esperimenti sono stati condotti su campioni di sangue intero di capre, provenienti da allevamenti del sud-Sardegna, e su un controllo positivo di coltura cellulare di cellule sinoviali di capra, di cui si è proceduto all’estrazione degli acidi nucleici con il kit “Dneasy Blood and Tissue” (Qiagen). Gli estratti sono stati quindi sottoposti ad una reazione di retrotrascrizione- amplificazione usando il kit Invitrogen One-step RT-PCR. Gli amplificati sono stati quindi analizzati tramite corsa elettroforetica su gel d'agarosio al 2%. I campioni presentanti una banda di amplificazione purificati con Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen), sono stati sottoposti alla reazione di Sanger per il sequenziamento, utilizzando il kit “Cycle sequencing kit BigDye Terminator V 1.1” (AB AppliedBiosystems). Il sequenziamento è stato eseguito utilizzando i sequenziatori semi-automatici ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) e ABI PRISM 3500 GENETIC ANALIZER (Applied Byosistem). Le sequenze ottenute sono state analizzate utilizzando il programma ChromasPro 2.31 (Technelysium Pty. Ltd.) e il software online ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) Risultati e conclusioni: Sono stati processati un totale di 50 campioni di estratti da sangue intero, 40 dei quali risultati positivi alla PCR, mostrando un segnale di amplificazione tra le 180 bp e le 220 bp. Il 50% dei campioni positivi sono stati sottoposti a sequenziamento e dopo analisi, con il software online BLAST (http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), è risultato che: 12 campioni hanno dato riscontro per quanto riguarda il virus Caev ( tabella 1) e 8 campioni non hanno portato esito conclusivo. Possiamo quindi affermare che i primers disegnati sono in grado di riconoscere la regione LTR-GAG dei vari genotipi del virus CAEV rimanendo tuttavia necessario per ora come esame di conferma il sequenziamento capillare