SISTEMA INTEGRATO RT-PCR SEQUENZIAMENTO P023
PER LA DIAGNOSI DI LABORATORIO PER INFEZIONE
DA VIRUS CAEV
M.C. Carassino1, D. Corda1, S. Fais2, G. Orrù2, M. Liciardi1
1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Struttura Complessa di Cagliari
2 Servizio di Biologia Molecolare (MBS) Azienda Ospedaliera Universitaria, Cagliari
Introduzione: Il virus dell'artite-encefalite caprina (CAEV) è un retrovirus, appartenente
al genere Lentivirus. I lentivirus dei piccoli ruminanti (SRLV) sono un gruppo di virus
eterogenei dal punto di vista genetico, antigenico e biologico. Gli SRLV comprendono
ad oggi almeno 5 genotipi, indicati con le lettere da A a E; in Italia sono presenti almeno
3 genotipi A(MV-like), B ed E. L'ELISA è il metodo diagnostico più diffuso in
quanto consente di avere risultati rapidi e poco costosi. Tuttavia il problema della sieroconversione
ritardata da parte dei soggetti infetti rende tali risultati poco significativi
nelle prime fasi dell'infezione. Scopo di questo lavoro è quello di mettere a punto una
modalità diagnostica molecolare, sensibile e specifica che individui i genotipi virali B
ed E, in particolare i ceppi Fonni, Volterra, Seui e Roccaverano [1,2].
Materiali e metodi: Il target per la PCR è stato identificato nella regione del genoma
LTR-GAG in una zona con alta percentuale di omologia disegnando una coppia di
primers degenerati in grado di identificare i 4 ceppi, amplificando un frammento da
180 a 230 paia di basi. Gli esperimenti sono stati condotti su campioni di sangue intero
di capre, provenienti da allevamenti del sud-Sardegna, e su un controllo positivo
di coltura cellulare di cellule sinoviali di capra, di cui si è proceduto all’estrazione degli
acidi nucleici con il kit “Dneasy Blood and Tissue” (Qiagen). Gli estratti sono stati
quindi sottoposti ad una reazione di retrotrascrizione- amplificazione usando il kit Invitrogen
One-step RT-PCR. Gli amplificati sono stati quindi analizzati tramite corsa
elettroforetica su gel d'agarosio al 2%. I campioni presentanti una banda di amplificazione
purificati con Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen), sono stati sottoposti
alla reazione di Sanger per il sequenziamento, utilizzando il kit “Cycle sequencing kit
BigDye Terminator V 1.1” (AB AppliedBiosystems). Il sequenziamento è stato eseguito
utilizzando i sequenziatori semi-automatici ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) e
ABI PRISM 3500 GENETIC ANALIZER (Applied Byosistem). Le sequenze ottenute
sono state analizzate utilizzando il programma ChromasPro 2.31 (Technelysium Pty.
Ltd.) e il software online ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)
Risultati e conclusioni: Sono stati processati un totale di 50 campioni di estratti da
sangue intero, 40 dei quali risultati positivi alla PCR, mostrando un segnale di amplificazione
tra le 180 bp e le 220 bp. Il 50% dei campioni positivi sono stati sottoposti
a sequenziamento e dopo analisi, con il software online BLAST
(http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), è risultato che: 12 campioni hanno dato riscontro
per quanto riguarda il virus Caev ( tabella 1) e 8 campioni non hanno portato esito
conclusivo.
Possiamo quindi affermare che i primers disegnati sono in grado di riconoscere la regione
LTR-GAG dei vari genotipi del virus CAEV rimanendo tuttavia necessario per
ora come esame di conferma il sequenziamento capillare