RTP801/REDD1 contributes to neuroinflammation severity and memory impairments in Alzheimer's disease

We found an unanticipated recovery of several gliosis hallmarks and inflammasome key proteins upon neuronal RTP801 downregulation in the 5xFAD mice. Altogether our results suggest that RTP801 could be a potential future target for theranostic studies since it could be a biomarker of neuroinflammation and neurotoxicity severity of the disease and, at the same time, a promising therapeutic target in the treatment of AD

Rtp801/redd1 is involved in neuroinflammation and modulates cognitive dysfunction in huntingtons disease

RTP801/REDD1 is a stress-regulated protein whose levels are increased in several neurodegenerative diseases such as Parkinson's, Alzheimer's, and Huntington's diseases (HD). RTP801 downregulation ameliorates behavioral abnormalities in several mouse models of these disorders. In HD, RTP801 mediates mutant huntingtin (mhtt) toxicity in in vitro models and its levels are increased in human iPSCs, human postmortem putamen samples, and in striatal synaptosomes from mouse models of the disease. Here, we investigated the role of RTP801 in the hippocampal pathophysiology of HD. We found that RTP801 levels are increased in the hippocampus of HD patients in correlation with gliosis markers. Although RTP801 expression is not altered in the hippocampus of the R6/1 mouse model of HD, neuronal RTP801 silencing in the dorsal hippocampus with shRNA containing AAV particles ameliorates cognitive alterations. This recovery is associated with a partial rescue of synaptic markers and with a reduction in inflammatory events, especially microgliosis. Altogether, our results indicate that RTP801 could be a marker of hippocampal neuroinflammation in HD patients and a promising therapeutic target of the disease

Neuron-derived extracellular vesicles contain synaptic proteins, promote spine formation, activate TrkB-mediated signalling and preserve neuronal complexity

Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication as carriers of signalling molecules such as bioactive miRNAs, proteins and lipids. EVs are key players in the functioning of the central nervous system (CNS) by influencing synaptic events and modulating recipient neurons. However, the specific role of neuron-to-neuron communication via EVs is still not well understood. Here, we provide evidence that primary neurons uptake neuron-derived EVs in the soma, dendrites, and even in the dendritic spines, and carry synaptic proteins. Neuron-derived EVs increased spine density and promoted the phosphorylation of Akt and ribosomal protein S6 (RPS6), via TrkB-signalling, without impairing the neuronal network activity. Strikingly, EVs exerted a trophic effect on challenged nutrient-deprived neurons. Altogether, our results place EVs in the spotlight for synaptic plasticity modulation as well as a possible therapeutic tool to fight neurodegeneration

RTP801: a novel regulator of the tRNA ligase complex in Alzheimer's disease

[eng] RTP801/REDD1 is a stress-responsive protein overexpressed in neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD) that contributes to cognitive deficits and neuroinflammation. Here we found that RTP801 interacts with HSPC117, DDX1, and CGI-99, three members of the tRNA ligase complex (tRNA-LC), which ligates the excised exons of intron-containing tRNAs and the mRNA exons of the transcription factor XBP1 during the unfolded protein response (UPR). We also found that RTP801 modulates the mRNA ligase activity of the complex in vitro, since RTP801 knockdown promoted XBP1 splicing and the expression of its transcriptional target, SEC24D. On the contrary, RTP801 overexpression inhibited the splicing of XBP1. In this line, in human AD postmortem hippocampal samples, where RTP801 protein levels are upregulated, we found that XBP1 splicing dramatically decreased. In the 5xFAD mouse model of AD, silencing RTP801 expression in hippocampal neurons promoted Xbp1 splicing and prevented the accumulation of intron-containing pre-tRNAs. Finally, the tRNA-enriched fraction obtained from 5xFAD mice promoted abnormal dendritic arborization in cultured hippocampal neurons, and RTP801 silencing in the source neurons prevented this phenotype. Altogether, these results show that elevated RTP801 impairs RNA processing in vitro and in vivo, in the context of AD and suggest that RTP801 inhibition could be a promising therapeutic approach.[spa] Las enfermedades neurodegenerativas son un conjunto de enfermedades devastadoras principalmente caracterizadas por la pérdida de poblaciones neuronales específicas. Entre las más destacadas se incluyen la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Huntington (EH) o la enfermedad de Parkinson (EP). En los últimos años se ha propuesto que un mecanismo patogénico común en las distintas enfermedades neurodegenerativas es una síntesis proteica alterada. Precisamente, los ARN mensajeros (ARNm) y de transferencia (ARNt) son elementos esenciales para una correcta traducción. El complejo ARNt ligasa es un complejo multiproteico descubierto en 2011 compuesto por las proteínas HSPC117, DDX1, CGI-99, FAM98B y ASW. Este complejo participa en el procesamiento de los ARNt con intrón y de ARNm específicos, como por ejemplo el ARNm del factor de transcripción XBP1. Concretamente, el complejo ARNt ligasa se encarga de ligar los exones después del corte endonucleolítico. Por lo tanto, un correcto funcionamiento de este complejo es clave para regular el reservorio de ARNt y ARNm de las células. RTP801 es una proteína de respuesta al estrés cuyos niveles están incrementados en los cerebros de pacientes con enfermedades neurodegenerativas como la EA, la EH o la EP. Resultados previos del grupo demostraron que el silenciamiento de RTP801 en el hipocampo de ratones modelo de la EA y de la EH mejoraba su cognición y reducía su neuroinflamación. Así pues, niveles aumentados de RTP801 parecen ser patológicos para el cerebro. Curiosamente, en resultados preliminares del grupo se observó que RTP801 interaccionaba físicamente con HSPC117 y DDX1, dos de los miembros del complejo ARNt ligasa. Por este motivo, nuestra hipótesis de trabajo en esta tesis era que los altos niveles de RTP801 en la EA podrían estar afectando el funcionamiento del complejo ARNt ligasa y, por ende, el reservorio de ARNt y ARNm celulares, lo que contribuiría a la exacerbación de la patología. Así pues, en el primer objetivo de esta tesis hemos estudiado la naturaleza de la interacción entre RTP801 y los miembros del complejo ARNt ligasa. Mediante la técnica de la inmunoprecipitación, confirmamos la interacción de RTP801 con HSPC117 y DDX1, y, además, observamos que RTP801 también interaccionaba con CGI-99, otro miembro del complejo. A continuación, analizamos si la interacción de RTP801 con el complejo podría estar estabilizando o desestabilizando dicho complejo. Observamos que los niveles proteicos de RTP801 no influían en los niveles proteicos de los miembros del complejo, ni en neuronas corticales de rata en cultivo ni en células HEK293 humanas. De forma similar, los niveles de RTP801 tampoco afectaban a la expresión genética de DDX1 ni de HSPC117. Estos resultados sugieren que RTP801 no estabiliza los miembros del complejo ARNt ligasa ni tampoco promueve su degradación. Por el contrario, observamos que los niveles proteicos de DDX1 y de HSPC117 sí que afectaban a los niveles proteicos de RTP801. Concretamente, DDX1 y HSPC117 parecían estabilizar a la proteína RTP801. Por el contrario, los niveles de DDX1 y HSPC117 no regulan la expresión genética de RTP801. Esto indica que la interacción de RTP801 con el complejo puede estar evitando su propia degradación por parte del proteasoma. Teniendo en cuenta que la interacción de RTP801 con el complejo no parecía estabilizadora ni de carácter estructural, nos planteamos que RTP801 podría estar modulando su actividad ARNm ligasa. Por ello, en el segundo objetivo de esta tesis investigamos el rol de RTP801 en la actividad ARNm ligasa del complejo sobre XBP1, tanto a nivel fisiológico como en el contexto de la EA. En primer lugar, observamos que el silenciamiento de RTP801 en células HEK293 promovía el empalme de XBP1 y la transcripción de una de sus dianas transcripcionales, llamada SEC24D. Por el contrario, la sobreexpresión de RTP801 en el mismo modelo celular inhibía el empalme de XBP1. Estos resultados indican que RTP801 inhibe el empalme de XBP1 in vitro, puesto que sus niveles están inversamente correlacionados. En segundo lugar, estudiamos el estado de RTP801, de los miembros del complejo y del empalme de XBP1 en muestras de hipocampo de pacientes de la EA. Confirmamos, como ya habíamos descrito anteriormente, que los niveles de RTP801 están aumentados en pacientes de la EA en comparación con individuos sanos. Sin embargo, los niveles de los miembros del complejo ARNt ligasa permanecían invariables entre condiciones. Sorprendentemente, el empalme de XBP1 estaba drásticamente alterado en el hipocampo de pacientes de la EA. Estos resultados indican que, a pesar de que los miembros del complejo no están alterados en la EA, su actividad parece estarlo. Además, descubrimos que los niveles proteicos de RTP801, de la forma ligada de XBP1 y de la forma fosforilada de una proteína marcadora de estrés reticular (eIF2α) eran muy buenos clasificadores de la presencia o ausencia de la EA. Por último, usamos ratones modelo de la EA (5xFAD) para estudiar el empalme de XBP1 in vivo, y el papel que RTP801 jugaba en él. Como en trabajos anteriores, inyectamos virus adenoasociados en el hipocampo de ratones control y de ratones 5xFAD con el objetivo de disminuir la expresión de RTP801 específicamente en las neuronas. Un mes después, aislamos el ARN del hipocampo para analizar el estado del empalme de Xbp1. Observamos que la disminución de la expresión de RTP801 promovía significativamente su empalme, de forma similar a los resultados obtenidos in vitro. Interesantemente, la disminución de la expresión de RTP801 en el hipocampo de ratones 5xFAD también promovía la expresión de una diana transcripcional de XBP1 llamada Bdnf, que resulta ser una neurotrofina muy importante para la plasticidad neuronal, el aprendizaje y la memoria. Así pues, los resultados del segundo objetivo de la tesis sugieren que RTP801, la cual está incrementanda en el contexto de la EA, inhibe el empalme de XBP1, y muy probablemente lo hace a través de su interacción con los miembros del complejo ARNt ligasa. Finalmente, en el tercer objetivo de esta tesis exploramos si RTP801 también inhibía la actividad ARNt ligasa del complejo, es decir, si RTP801 podía modular el empalme de los ARNt con intrón. Para ello, aprovechamos el modelo animal descrito en el segundo objetivo y a partir del RNA obtenido aislamos la fracción de ARN que contiene mayormente los ARNt. Una parte de este ARNt lo usamos para experimentos de secuenciación y la otra parte para analizar su posible toxicidad y su funcionalidad. Con respecto a los experimentos de secuenciación, observamos que los ratones 5xFAD presentaban una acumulación de ARNt inmaduro (pre-ARNt) en el hipocampo, pero solo de aquellas familias de ARNt que presentan intrón. Estos resultados sugieren que en los ratones 5xFAD hay un problema en el procesamiento de ARNt, y específicamente en su empalme. Para dilucidar si RTP801 podía estar jugando un papel en este empalme aberrante, estudiamos los niveles de pre-ARNt exclusivamente para aquellas familias de ARNt con intrón en el hipocampo de las siguientes condiciones: ratones control y ratones 5xFAD, con o sin disminución de la expresión de RTP801. Sorprendentemente, observamos que casi todos los pre-ARNt se acumulaban en los ratones 5xFAD y que el silenciamiento de RTP801 prevenía este fenómeno. En otras palabras, RTP801 realmente estaba contribuyendo a la acumulación de pre-ARNt con intrón en los ratones 5xFAD, probablemente mediante la inhibición del complejo ARNt ligasa. En último lugar, analizamos si los ARNt procedentes de los ratones 5xFAD eran tóxicos para neuronas en cultivo, o si afectaban a su arborización. Para ello, transfectamos neuronas hipocampales en cultivo con ARNt procedente de las condiciones experimentales indicadas anteriormente, y realizamos una inmunofluorescencia. Para ello se utilizó un anticuerpo contra MAP2 para marcar las neuronas y un anticuerpo contra la proteína caspasa 3 activa como marcador de apoptosis incipiente. Observamos que el ARNt transfectado no era tóxico en ninguna de las condiciones, a juzgar por el grado de condensación de la cromatina y por la intensidad y la distribución del marcaje para la caspasa 3 activa. Sin embargo, en referencia al efecto de los ARNt sobre la arborización neuronal, observamos que los ARNt provenientes del hipocampo de ratones 5xFAD inyectados con los virus control inducían un aumento de la ramificación neuronal, el cual era prevenido por el noqueo de RTP801. Estos resultados sugieren que el reservorio de pre-ARNt diferencial de los ratones 5xFAD sin noqueo de RTP801 puede influir en la ramificación de las neuronas, sin llegar a afectar su viabilidad. En conjunto, en esta tesis demostramos el rol inhibitorio de RTP801 en la actividad ARNm ligasa y ARNt ligasa del complejo ARNt ligasa. Además, presentamos este rol como un nuevo mecanismo patológico en la EA, que puede contribuir a su exacerbación. Por tanto, esta tesis describe una nueva función de la proteína RTP801 la cual tendrá que ser estudiada en mayor profundidad, ya que supone una potencial diana terapéutica para la EA

RTP801 mediates transneuronal toxicity in culture via extracellular vesicles

Abstract Extracellular vesicles (EVs) play a crucial role in intercellular communication, participating in the paracrine trophic support or in the propagation of toxic molecules, including proteins. RTP801 is a stress‐regulated protein, whose levels are elevated during neurodegeneration and induce neuron death. However, whether RTP801 toxicity is transferred trans‐neuronally via EVs remains unknown. Hence, we overexpressed or silenced RTP801 protein in cultured cortical neurons, isolated their derived EVs (RTP801‐EVs or shRTP801‐EVs, respectively), and characterized EVs protein content by mass spectrometry (MS). RTP801‐EVs toxicity was assessed by treating cultured neurons with these EVs and quantifying apoptotic neuron death and branching. We also tested shRTP801‐EVs functionality in the pathologic in vitro model of 6‐Hydroxydopamine (6‐OHDA). Expression of RTP801 increased the number of EVs released by neurons. Moreover, RTP801 led to a distinct proteomic signature of neuron‐derived EVs, containing more pro‐apoptotic markers. Hence, we observed that RTP801‐induced toxicity was transferred to neurons via EVs, activating apoptosis and impairing neuron morphology complexity. In contrast, shRTP801‐EVs were able to increase the arborization in recipient neurons. The 6‐OHDA neurotoxin elevated levels of RTP801 in EVs, and 6‐OHDA‐derived EVs lost the mTOR/Akt signalling activation via Akt and RPS6 downstream effectors. Interestingly, EVs derived from neurons where RTP801 was silenced prior to exposing them to 6‐OHDA maintained Akt and RPS6 transactivation in recipient neurons. Taken together, these results suggest that RTP801‐induced toxicity is transferred via EVs, and therefore, it could contribute to the progression of neurodegenerative diseases, in which RTP801 is involved

RTP801/REDD1 contributes to neuroinflammation severity and memory impairments in Alzheimer’s disease

Abstract RTP801/REDD1 is a stress-regulated protein whose upregulation is necessary and sufficient to trigger neuronal death. Its downregulation in Parkinson’s and Huntington’s disease models ameliorates the pathological phenotypes. In the context of Alzheimer’s disease (AD), the coding gene for RTP801, DDIT4, is responsive to Aβ and modulates its cytotoxicity in vitro. Also, RTP801 mRNA levels are increased in AD patients’ lymphocytes. However, the involvement of RTP801 in the pathophysiology of AD has not been yet tested. Here, we demonstrate that RTP801 levels are increased in postmortem hippocampal samples from AD patients. Interestingly, RTP801 protein levels correlated with both Braak and Thal stages of the disease and with GFAP expression. RTP801 levels are also upregulated in hippocampal synaptosomal fractions obtained from murine 5xFAD and rTg4510 mice models of the disease. A local RTP801 knockdown in the 5xFAD hippocampal neurons with shRNA-containing AAV particles ameliorates cognitive deficits in 7-month-old animals. Upon RTP801 silencing in the 5xFAD mice, no major changes were detected in hippocampal synaptic markers or spine density. Importantly, we found an unanticipated recovery of several gliosis hallmarks and inflammasome key proteins upon neuronal RTP801 downregulation in the 5xFAD mice. Altogether our results suggest that RTP801 could be a potential future target for theranostic studies since it could be a biomarker of neuroinflammation and neurotoxicity severity of the disease and, at the same time, a promising therapeutic target in the treatment of AD

Neuron‐derived extracellular vesicles contain synaptic proteins, promote spine formation, activate TrkB‐mediated signalling and preserve neuronal complexity

Abstract Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication as carriers of signalling molecules such as bioactive miRNAs, proteins and lipids. EVs are key players in the functioning of the central nervous system (CNS) by influencing synaptic events and modulating recipient neurons. However, the specific role of neuron‐to‐neuron communication via EVs is still not well understood. Here, we provide evidence that primary neurons uptake neuron‐derived EVs in the soma, dendrites, and even in the dendritic spines, and carry synaptic proteins. Neuron‐derived EVs increased spine density and promoted the phosphorylation of Akt and ribosomal protein S6 (RPS6), via TrkB‐signalling, without impairing the neuronal network activity. Strikingly, EVs exerted a trophic effect on challenged nutrient‐deprived neurons. Altogether, our results place EVs in the spotlight for synaptic plasticity modulation as well as a possible therapeutic tool to fight neurodegeneration

Increased phospho-AKT in blood cells from LRRK2 G2019S mutation carriers

To investigate whether differential phosphorylation states of blood markers can identify LRRK2 Parkinson's disease (PD) patients, we assessed phospho(P)-Ser-935-LRRK2 and P-Ser-473-AKT levels in peripheral blood cells from G2019S LRRK2-associated PD patients (L2PD, n=31), G2019S LRRK2 non-manifesting carriers (L2NMC, n=26), idiopathic PD (iPD, n=25), and controls (n=40) (total n=122). We found no differences at P-Ser-935-LRRK2 between groups but detected a specific increase of P-Ser-473-AKT levels in all G2019S carriers, either L2PD or L2NMC, absent in iPD. Although insensitive to LRRK2 inhibition, our study identifies P-Ser-473-AKT as an endogenous candidate biomarker for peripheral inflammation in G2019S carriers using accessible blood cells. This article is protected by copyright. All rights reserved

Increased Phospho-AKT in Blood Cells from LRRK2 G2019S Mutation Carriers

The purpose of this study was to investigate whether differential phosphorylation states of blood markers can identify patients with LRRK2 Parkinson's disease (PD). We assessed phospho(P)-Ser-935-LRRK2 and P-Ser-473-AKT levels in peripheral blood cells from patients with G2019S LRRK2-associated PD (L2PD, n = 31), G2019S LRRK2 non-manifesting carriers (L2NMC, n = 26), idiopathic PD (iPD, n = 25), and controls (n = 40, total n = 122). We found no differences at P-Ser-935-LRRK2 between groups but detected a specific increase of P-Ser-473-AKT levels in all G2019S carriers, either L2PD or L2NMC, absent in iPD. Although insensitive to LRRK2 inhibition, our study identifies P-Ser-473-AKT as an endogenous candidate biomarker for peripheral inflammation in G2019S carriers using accessible blood cells. ANN NEUROL 2022;92:888-894

RTP801 regulates motor cortex synaptic transmission and learning

Background: RTP801/REDD1 is a stress-regulated protein whose upregulation is necessary and sufficient to trigger neuronal death in in vitro and in vivo models of Parkinson's and Huntington's diseases and is up regulated in compromised neurons in human postmortem brains of both neurodegenerative disorders. Indeed, in both Parkinson's and Huntington's disease mouse models, RTP801 knockdown alleviates motor-learning deficits. Results: We investigated the physiological role of RTP801 in neuronal plasticity and we found RTP801 in rat, mouse and human synapses. The absence of RTP801 enhanced excitatory synaptic transmission in both neuronal cultures and brain slices from RTP801 knock-out (KO) mice. Indeed, RTP801 KO mice showed improved motor learning, which correlated with lower spine density but increased basal filopodia and mushroom spines in the motor cortex layer V. This paralleled with higher levels of synaptosomal GluA1 and TrkB receptors in homogenates derived from KO mice motor cortex, proteins that are associated with synaptic strengthening.Conclusions: Altogether, these results indicate that RTP801 has an important role modulating neuronal plasticity and motor learning. They will help to understand its role in neurodegenerative disorders where RTP801 levels are detrimentally upregulated