Determination of a general mode of microRNA action and functional characterization of specific microRNAs in Drosophila melanogaster

Die präzise Regulierung der Genexpression ist grundlegend in der Entwicklung eines Organismus. Die Entdeckung von microRNAs (miRNAs) als post-transkriptionelle Regulatoren erweiterte die Komplexität der Genexpression um eine neue Dimension. miRNAs haben das Potential, einen großen Teil des Genoms zu regulieren. Aus diesem Grund bedarf es sorgfältiger funktioneller Charakterisierung von einzelnen miRNAs, um herauszufinden, welche dieser möglichen Zielgene (“Targets”) tatsächlich physiologisch relevant sind. In der hier vorgelegten Arbeit beschreibe ich Bemühungen, die Bedeutung von miRNAs in der Entwicklung von Drosophila Melanogaster aufzuklären. Ich war an einer globalen Analyse der Expressionsmuster von miRNAs und ihrer vorhergesagten Targets beteiligt, die aufzeigte, dass viele miRNAs nicht mit ihren Targets co-exprimiert werden. Dies deutete darauf hin, dass miRNAs die Expression von unerwünschten Genen, die nur in sehr niedriger Menge in der Zelle vorhanden sind, verhindern. In Zusammenarbeit mit Alexander Stark fanden wir weitere Anhaltspunkte für diese Hypothese, als wir den miR-iab-4 Locus und seine Rolle in der Hox-Gen Regulierung untersuchten. Die hochkonservierten Homöobox (Hox)–Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren, die für die Entwicklung vielzelliger Organismen unentbehrlich sind. Unsere Analyse ergab, dass vom miR-iab-4 Locus zwei verschiedene miRNAs exprimiert werden, jeweils vom Plus- und vom Minusstrang. Diese miRNAs werden unterschiedlich exprimiert, und unterstützen so die transkriptionelle Regulierung der Hoxgene untereinander. Folglich wird die korrekte Expression von Hoxproteinen primär transkriptionell und sekundär zusätzlich durch die miRNAs des miR-iab-4 Locus reguliert. Weiters charakterisierte ich die Rolle des miR-309 Clusters während der frühen Embryonalentwicklung, indem ich eine Mutante erzeugte, der dieser Cluster fehlte. Das miR-309 Cluster kodiert für sechs verschiedene miRNAs, deren Expression zu Beginn der zygotischen Genexpression aktiviert wird. Durch Analyse von Microarrayprofilen gelang es mir, eine Reihe von in vivo Targets des miR-309 clusters zu identifizieren. Ich konnte damit zeigen, dass diese miRNAs für die rechtzeitige Entfernung maternaler Transkripte notwendig sind. Auch diese miRNAs sind nicht mit ihren Targets gemeinsam, sondern zeitlich versetzt exprimiert. In diesem Fall tragen die miRNAs stark zur Reduktion der Transkriptmenge bei und festigen somit das einander ausschließende Expressionsmuster. Interessanterweise wurde eine vergleichbare Rolle auch für eine andere miRNA, miR-430, in Zebrafish beschrieben, was auf konvergente Evolution hindeutet. Zusammengenommen ist es mir in dieser Arbeit gelungen, einige der zahlreichen regulatorischen Funktionen von ausgewählten miRNAs im Zusammenspiel mit ihren physiologiosch relevanten Targets zu charakterisieren. Die Aufgaben von miRNAs in der Entwicklung können subtil sein, aber sie können wesentlich dazu beitragen, ein genetisch robustes Entwicklungsprogramm sicherzustellen. Unter einem evolutionären Gesichtspunkt betrachtet erweisen sich miRNAs daher als ein ausgesprochen nützliches Werkzeug der Natur.The accurate regulation of gene expression is essential for animal development. The discovery of microRNAs (miRNAs) as post-transcriptional regulators added a new layer of complexity to gene expression programs. miRNAs potentially target a large fraction of the genome. However, identification of physiologically relevant targets requires meticulous functional characterization of individual miRNAs. In the work presented I describe efforts to elucidate the biological roles of miRNAs in the development of Drosophila melanogaster. I was involved in a global analysis of the expression patterns of miRNAs and their predicted targets, which revealed that many miRNAs are not co-expressed with their targets. This suggested that miRNAs might act by preventing the expression of unwanted transcripts that are present only at very low levels in the miRNA expressing cell. In collaboration with Alexander Stark, we found more evidence for this hypothesis when we investigated the miR-iab-4 locus and its role in Hox gene regulation. Homeobox - containing (Hox) transcription factors are encoded by highly conserved genes fundamentally required during animal development. We found that the miR-iab-4 locus gives rise to two distinct miRNAs, one derived from the sense, and the other from the antisense strand. These miRNAs are expressed in nonoverlapping domains and are required to support the transcriptional repression conferred by Hox genes among each other. Therefore, the transcriptional regulation is the primary, and miRNA-mediated regulation the secondary level to reinforce the Hox protein expression domains. Furthermore, I investigated the role of the miR-309 cluster during early embryogenesis by generating a deletion mutant of this cluster. The mir-309 cluster contains six distinct miRNAs, which are induced during the onset of zygotic transcription. Using microarray profiling, I identified a set of in vivo targets of the miR-309 cluster and could show that these miRNAs are required for the timely downregulation of maternally deposited transcripts during the maternal to zygotic transition. Again, the miRNAs and their targets were expressed in a temporally nonoverlapping manner. In this case, the miRNAs substantially contribute to downregulation of the target’s transcript levels, thereby helping to shape the nonoverlapping expression pattern. Intriguingly, a comparable role was described for the unrelated miRNA miR-430 in zebrafish, suggesting convergent evolution. Taken together, I was able to identify some of the complex regulatory relationships between selected miRNAs and their targets in Drosophila. I found evidence that the miRNAs’ roles in development can be subtle, but may serve to ensure robustness of the developmental program, which is of significant importance from an evolutionary point of view

Drosophila microRNAs 263a/b Confer Robustness during Development by Protecting Nascent Sense Organs from Apoptosis

microRNA-263a/b confer robustness to sense organ development by controlling expression of the pro-apoptotic gene hid during apoptotic tissue pruning in Drosophila

An intuitive graphical visualization technique for the interrogation of transcriptome data

The complexity of gene expression data sets generated from microarrays and high-throughput sequencing make their analysis challenging. One goal of these analyses is to define sets of co-regulated genes and identify patterns of gene expression. To date, however, there is a lack of easily implemented methods that allow an investigator to visualize and interact with the data in an intuitive and flexible manner. Here, we show that combining a nonlinear dimensionality reduction method, t-statistic Stochastic Neighbor Embedding, with a novel visualization technique provides a graphical mapping that allows the intuitive investigation of transcriptome data. This approach performs better than commonly used methods, offering insight into underlying patterns of gene expression at both global and local scales and identifying clusters of similarly expressed genes. A freely available MATLAB-implemented graphical user interface to perform t-SNE and nearest neighbour plots on genomic data sets is available at www.nimr.mrc.ac.uk/research/james-briscoe/ visgene

Recombinase-Mediated Cassette Exchange Provides a Versatile Platform for Gene Targeting: Knockout of miR-31b

A series of vectors has been designed to enhance the versatility of targeted homologous recombination. Recombinase-mediated cassette exchange permits sequential targeting at any locus and improves flexibility in making user-defined mutations. Application of RMCE to delete an intronic microRNA gene is described