Genetic disorders of neurotransmitter release machinery

Synaptic neurotransmitter release is an evolutionarily conserved process that mediates rapid information transfer between neurons as well as several peripheral tissues. Release of neurotransmitters are ensured by successive events such as synaptic vesicle docking and priming that prepare synaptic vesicles for rapid fusion. These events are orchestrated by interaction of different presynaptic proteins and are regulated by presynaptic calcium. Recent studies have identified various mutations in different components of neurotransmitter release machinery resulting in aberrant neurotransmitter release, which underlie a wide spectrum of psychiatric and neurological symptoms. Here, we review how these genetic alterations in different components of the core neurotransmitter release machinery affect the information transfer between neurons and how aberrant synaptic release affects nervous system function

DNA Repair Based Therapy in Oncology and Neurodegeneration

WOS: 000378333000015

Glofitamab in relapsed/refractory diffuse large B cell lymphoma: Real world data

Abstract INTRODUCT ̇ION Glofitamab is a T-cell-engaging bispecific antibody connecting CD20 on B cells and CD3 on T cells. Although, most of the patients with B-cell non-Hodgkin lymphoma (BNHL) achieve complete response (CR) following firstline treatment with rituximab and chemotherapy, about 40% of patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is refractory or relapse (R/R). Autologous stem-cell transplantation (ASCT) can cure some of these patients but many patients cannot undergo this procedure. CAR-T therapies are a significant advance but not available in many countries like Turkey. In Phase II expansion study, the overall response rate (ORR) was 51.6% and complete remission (CR) rate was 39.4% in R/R DLBCL patients (Dickinson er al. JCO 2022). In this retrospective study, we aimed to report the outcomes of patients who used glofitamab via compessionate use in Turkey

Polatuzumab vedotin, rituximab, and bendamustine combination in relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma: A real-world data from Turkey

Polatuzumab vedotin (Pola) with bendamustine and rituximab (BR) is a promising option for patients with relapsed/refractory (R/R) diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). We analyzed the data of 71 R/R DLBCL patients who had been treated with Pola-BR in the named patient program from March 2018 to April 2021 from 32 centers in Turkey. All patients received up to six cycles of Pola 1.8 mg/kg, rituximab 375 mg/m2 on day 1, and bendamustine 90 mg/m2 on days 1–2 of each cycle. Median age at Pola-BR initiation was 55 (19–84). The overall response rate was 47.9%, including 32.4% CR rate when a median of 3 cycles was applied. With a median follow-up of 5 months, the median OS was 5 months. Grade 3–4 neutropenia and thrombocytopenia were the most common hematological toxicities. The real-world data from our cohort showed the Pola-BR is an effective option with a manageable toxicity profile

Farede Optogenetik Yolla Tetiklenen Kortikal Yayılan Depresyonun Subkortikal Yayılım Mekanizmalarının İncelenmesi

Bu çalışma Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (TSA-2017-14206) tarafından desteklenmektedir.Uzay B. Investigation of the Subcortical Spreading Mechanisms of the Optogenetically Induced Cortical Spreading Depression in Mice, Hacettepe University Graduate School of Health Sciences Basic Neurological Sciences (Neuroscience) Program, Doctor of Philosophy Thesis, Ankara, 2019.Migraine is a neurological disorder characterized by severe headache attacks. Cortical spreading depression (CSD) is known to be the electrophysiological correlate of migraine aura. CSD results in opening of pannexin-1 megachannels that release ATP in the cortex and triggers parenchymal neurogenic inflammation that precedes meningeal inflammation which is thought to cause migraine headache. Symptoms suggesting subcortical dysfunction are observed during migraine attacks and subcortical structures are known to be affected. It is known that CSD spreads to the subcortical structures, whose mechanisms are yet not completely elucidated. In our study, the effects of purinergic P2X7 receptors on the subcortical spread of CSD and the response of subcortical structures following CSD were investigated using a potent and selective P2X7R antagonist. Experiments were performed in male C57BL6 transgenic mice of the Thy1-ChR2 genotype by inducing CSD optogenetically. Optogenetic CSD threshold was 17.9 mJ, values were accumulated below 30 mJ threshold, and there was no difference between heterozygous and homozygous mice. P2X7R antagonism had no effect on the CSD threshold. In the hypothalamic electrophysiological recordings that were done while triggering CSD, a direct current shift was observed at a mean amplitude of 0.8 mV with a mean delay of 51 seconds. P2X7R antagonism had no effect on this direct current shift. In subcortical structures that were investigated (thalamus, hypothalamus, striatum, hippocampus) and in cortex, expression of P2X7R receptor was increased after CSD, NF-kappa B-p65 was translocated to the nucleus in the astrocytes and c-fos positivity was increased in the hypothalamus. These effects could all be reversed by P2X7R antagonism. In order to investigate neurogenic inflammation in the cortex following CSD in an in vivo setup, an adeno-associated virus (AAV) carrying ‘NF-κB-RE-EGFP’ construct was injected intracortically, CSD was induced by using 1 M KCl-soaked cotton balls and the cortex was imaged by confocal microscope. The preliminary results showed an increase in the signal that was not observed under P2X7R antagonism. In conclusion, P2X7 receptors play an important role in neuronal activation in the hypothalamus after CSD, in the neurogenic inflammation in the cortex and subcortical structures; however, it may not have a direct role in the electrophysiological spread of CSD to subcortical structures. P2X7 receptors may be used as a target in the prophylaxis and treatment of migraine.ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xiii ŞEKİLLER DİZİNİ xiv TABLOLAR DİZİNİ xviii 1. GİRİŞ 1 2.GENEL BİLGİLER 4 2.1. Migren 4 2.1.1. Migrenin Klinik Özellikleri 4 2.1.2. Migren ve Trigeminovasküler Sistem 5 2.1.3. Migren ve KYD 7 2.1.4. Migren, KYD ve Nörojenik İnflamasyon 8 2.1.5. Migren ve Hipotalamus 11 2.2. Kortikal Yayılan Depresyon 12 2.2.1. Kortikal Yayılan Depresyonun in vivo Modelleri ve Optogenetik Yol ile Tetiklenmesi 12 2.2.2. Kortikal Yayılan Depresyonun Subkortikal Dokularda Yayılımı 14 2.3. Pürinerjik Sistem 16 2.3.1. Pürinerjik Sistemin Üyeleri 17 2.3.2 P2X7 Kanallarının İnflamasyondaki Rolü 18 2.3.3. P2X7 Kanalları ile KYD Arasındaki İlişki 19 2.4 Nükleer Faktör-Kappa B 20 3. GEREÇ VE YÖNTEM 24 3.1. Deney Hayvanları ve Barınma Koşulları 24 3.2. Anestezi ve Yaşamsal Bulguların Takibi 24 3.3. Cerrahi İşlemler 26 3.3.1. Optogenetik KYD Eşiği Belirlenmesinde Uygulanan Cerrahi 26 3.3.2. İntrakortikal AAV Enjeksiyonu 26 3.3.3. İn vivo NFkB Görüntülemesi için Yapılan Cerrahi 27 3.4. Optogenetik Uyarımın Yapıldığı Thy1-ChR2 Transgenik Hayvanların Genotiplenmesi 28 3.5. Elektrofizyoloji Deneyleri 29 3.5.1. Optogenetik KYD Eşiğinin Belirlenmesi 29 3.5.2. Optogenetik Yolla KYD İndüklenmesi için Optimize Protokolün Oluşturulması 30 3.5.3. KYD’nin Subkortikal Yayılımının İncelenmesi 31 3.6. AAV Üretimi 32 3.6.1. Plazmid Klonlaması 32 3.6.2. E. Coli-DL21 Kompetan Hale Getirilmesi 32 3.6.3. Transformasyon ile Plazmidlerin E.Coli Tarafından Üretiminin Sağlanması 32 3.6.4. Saflaştırılan Plazmidlerin Restiriksiyon Enzimleri ile Kesilerek (RFLP) Doğrulanması 36 3.6.5. HEK293T Hücre Kültürü 37 3.6.6. Üçlü Ko-Transfeksiyon Yöntemiyle AAV Üretimi 37 3.6.7. İodixanol Gradiyanti ile Virüsün Saflaştırılması 37 3.6.8. Virüsün Titre Edilmesi 38 3.7. Farmakolojik Ajanların Uygulanması 39 3.8. İmmünoflöresan Boyamalar 39 3.8.1 İndirekt İmmünoflöresan 40 3.8.2 İmmünosinyal Hibrdizasyon Zincir Reaksiyonu (isHCR) 41 3.9. Western Blotlama 42 3.10. Elde Edilen Görüntülerin Analizi 43 3.11. İstatistiksel Yöntemler 44 4. BULGULAR 47 4.1. Optogenetik Yolla Tetiklenen KYD Eşiğinin Belirlenmesi ve Eşik Protokolünün Optimize Edilmesi 47 4.2. Optogenetik Yolla Tetiklenen KYD Eşiğinin Heterozigot ve Homozigot Hayvanlar Arasındaki Farkı 49 4.3. P2X7R Antagonizminin Optogenetik Yolla Tetiklenen KYD Eşiğine Olan Etkisinin Belirlenmesi 50 4.4. Hipotalamik elektrofizyolojik kayıt ile KYD’nin subkortikal yayılımının gösterilmesi 52 4.5. P2X7R Antagonizminin KYD’nin subkortikal yayılımına olan etkisinin belirlenmesi 53 4.6. Optogenetik yolla tetiklenen KYD sonrası P2X7R Antagonisti verilmiş ve verilmemiş gruplarda kortikal ve subkortikal yapılardaki astrositlerdeki NFkB-p65 translokasyonunun incelenmesi 55 4.7. Optogenetik yolla tetiklenen KYD sonrası P2X7R Antagonisti verilmiş ve verilmemiş gruplarda kortikal ve subkortikal yapılardaki P2X7 Reseptörünün incelenmesi 66 4.8. Optogenetik yolla tetiklenen KYD’nin kortikal ve subkortikal yapılarda P2X7 reseptörünün etki ettiği hücre alt tiplendirmesinin yapılması 76 4.9.P2X7R Antagonizminin optogenetik yolla tetiklenen KYD sonrası hipotalamik c-fos ifadesine olan etkisinin incelenmesi 78 4.10. Optogenetik yolla tetiklenen KYD sonrası, P2X7R antagonisti verilmiş ve verilmemiş gruplarda kortikal ve subkortikal yapılarda P2X7 reseptörü ifadesinin western blotlama incelenmesi 80 4.11. AAV Üretiminde Kullanılan Plazmidlerin Rekombinasyon Olmadan Klonlandığının Sanger Sekanslamayla Gösterilmesi 83 4.12. İntrakortikal AAV enjekte edilmiş hayvanlarda in vivo NF-κB görüntülemesi 86 5.TARTIŞMA 90 5.1. Optogenetik Yolla KYD İndüklenmesi 90 5.2. KYD’nin Subkortikal Yayılımı 92 5.3. KYD ve Pürinerjik P2X7 reseptörleri 96 5.3.1 P2X7 Antagonizması ve KYD’nin Subkortikal Yayılımı 98 5.3.2 KYD’nin P2X7 Reseptörlerine Olan Etkisi 98 5.4. KYD ve Nöroinflamasyon 101 6.SONUÇ VE ÖNERİLER 104 7.KAYNAKLAR 106 8.EKLER EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Etik Kurul İzinleri EK-1: Tez Çalışması Orjinallik Raporu 9. ÖZGEÇMİŞUzay B. Farede Optogenetik Yolla Tetiklenen Kortikal Yayılan Depresyonun Subkortikal Yayılım Mekanizmalarının İncelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Temel Nörolojik Bilimler (Neuroscience) Programı, Doktora Tezi, Ankara, 2019.Migren tekrarlayıcı, şiddetli baş ağrısı ataklarıyla kendini gösteren nörolojik bir bozukluktur. Kortikal yayılan depresyonun (KYD), migren aurasının elektrofizyolojik karşılığı olduğu bilinmektedir. KYD kortekste hücre dışına ATP salıveren panneksin-1 megakanallarını açmakta ve parankimal nörojenik inflamasyonu tetiklemektedir. Bu inflamasyonu izleyen meningeal inflamasyonun migren baş ağrısına neden olduğu düşünülmektedir. Migrenin atağı sırasında subkortikal disfonksiyonu düşündüren semptomlar görülmekte, subkortikal yapılar etkilenmektedir. KYD’nin subkortikal yapılara yayıldığı gözlenmiş ancak buna neden olan mekanizmalar aydınlatılamamıştır. Çalışmamızda pürinerjik P2X7 reseptörlerinin KYD’nin subkortikal yayılımına ve KYD sonrası subkortikal yapılarda gerçekleşen yanıta olan etkileri potent ve selektif bir P2X7R antagonisti kullanılarak incelenmiştir. Deneyler, Thy1-ChR2 genotipindeki C57BL6 erkek transgenik farelerde optogenetik yolla KYD tetiklenerek gerçekleştirilmiştir. Optogenetik KYD eşiğinin ortalama 17,9 mJ olduğu, elde edilen eşik değerlerinin 30 mJ altında toplandığı, heterozigot ve homozigot fareler arasında bir fark olmadığı görülmüştür. P2X7R antagonizmasının eşik değerlerine ve KYD parametrelerine etkisi olmamıştır. KYD tetiklenirken alınan hipotalamik elektrofizyolojik kayıtlarda, KYD kaydından ortalama 51 saniye sonra, ortalama 0,8 mV amplitüdünde bir direkt akım kayması gözlenmiştir. P2X7R antagonizmasının bu direkt akım kaymasına etkisi olmamıştır. Deneylerden sonra elde edilen beyin dokularında; incelenen subkortikal yapılarda (talamus, hipotalamus, striatum, hipokampus) ve kortekste KYD sonrasında P2X7 reseptörü ifadesinde artış olduğu, astrositlerde NF-kappa B’nin p65 alt ünitesinin çekirdeğe göç ettiği ve hipotalamusta c-fos pozitifliğinin arttığı gözlenmiştir. Bu etkiler P2X7R antagonizmasıyla engellenebilmiştir. KYD sonrası kortekste gelişen nörojenik inflamasyonun in vivo incelenebilmesi amacıyla intrakortikal ‘NF-κB-RE-EGFP’ plazmidi içeren adeno-asosiye virüs (AAV) enjeksiyonu yapılmış, 1 M KCl kullanılarak KYD indüklenmiş ve konfokal mikroskopta kayıt alınmıştır. Bu deney sonucu elde edilen ön bulgularda sinyal gücünde artış gözlenmiştir. P2X7R antagonizması altında bu artış gözlenmemiştir. Sonuçta P2X7 reseptörlerinin; KYD sonrası hipotalamustaki nöronal aktivasyonda, kortekste ve subkortikal yapılardaki nörojenik inflamasyonda önemli bir rolü vardır; ancak KYD’nin subkortikal yapılara elektrofizyolojik yayılımında direkt rolü olmayabilir. P2X7 reseptörleri migren profilaksisinde ve tedavisinde hedef molekül olarak kullanılabilir

Permittivity-based classification by the integration of impedance cytometry and microwave sensing

The direct determination of the permittivity of individual micro-objects has proven challenging due to the convoluting effect of their geometric size on capacitive signals (i.e., on the electric size of a particle). To overcome this challenge, we have developed a sensing platform to independently obtain both the geometric and electric size of organic and inorganic particles, by combining impedance cytometry and microwave resonant sensing in a microfluidic chip. This way the microwave signal is normalized to yield an intrinsic parameter that depends only on permittivity. The permittivity can then be used for material classification or single-cell interrogation

Microwave resonators enhanced with 3D liquid-metal electrodes for microparticle sensing in microfluidic applications

In electrical sensing applications, achieving a uniform electric field at the sensing region is required to eliminate the compounding effect of particle location on the signal magnitude. To generate a uniform electric field in a microfluidic platform, 3D electrodes based on conductive electrolyte liquids have been developed before, where the ionic conductivity of the electrolyte was sufficient for impedance measurements at low frequencies (typically lower than 50 MHz). However, electrolyte liquids cannot be used as electrodes at microwave frequencies (>1 GHz) due to the low mobility of ions. Here, we used Galinstan, a room-temperature liquid metal, to microfabricate 3D liquid electrodes connected to a microwave resonator — and all integrated within a microfluidic system. By generating a highly uniform electric field, a mixture of 20 μm and 30 μm diameter polystyrene particles were measured and analyzed without any calibration for particle position. The results demonstrate the utility of liquid electrodes in enhancing the electrical characteristics of microwave resonant sensors

Position-independent microparticle sensing: microwave sensors integrated with metalized, 3D microelectrodes

Microfluidics integrated microwave sensors can be used for high throughput and label-free sensing with single particle resolution. For microwave sensors with coplanar electrodes, electric field is nonuniform over the height of microfluidic channel, causing position dependent sensitivity. One way to resolve positional dependency is to place electrodes on the sidewalls of microfluidic channel to obtain uniform electric field. Here, we demonstrate a novel, metal coated 3D SU8 microelectrode integrated with microwave resonator to obtain uniform electric field inside microfluidic channel and mitigate position dependent sensitivity. SU8 electrodes are positioned at the sensing region of the resonator, in contact with the microfluidic channel walls. During microparticle sensing experiments, phase and amplitude of the resonator are tracked using custom built single side band detection circuitry to detect particle induced shifts in these signals. Results of particle sensing, and size classification experiments indicate that with 3D SU8 electrode integrated microwave resonators, position-independent sensitivity can be achieved