Corderos y terneros multitransgénicos expresando proteínas fluorescentes obtenidos por transferencia de genes mediada por espermatozoides

The aim was to increase the number of reproductively viable and genetically modified embryos and adult farm animals accomplished by “sperm-mediated gene transfer” (SMGT). Currently, there are few advances in this area because of the low performance of the existing techniques and their excessive cost. Based on the positive results obtained by In-Vitro Fertilization (IVF) of oocytes obtained from ovaries from abattoir, a protocol was developed that applies the SMGT technique through Laparoscopic Artificial Insemination (IAUL) with semen treated in synchronized and superovulated sheep. To this aim, 4 adult Friesian sheep were subjected to hormonal treatments to achieve multiovulatory oestrus on pre-designed dates. Of the four sheep, all inseminated by IAUL, one (control) was served with semen without treatment and three, with treated semen. Seven days later, one of the sheep inseminated with treated semen produced 9 eggs, three of them fertilized with different cell multiplication status. The three embryos expressed the plasmids incorporated by treated sperm in all their blastomeres. None of the unfertilized oocytes showed red or green fluorescence. Two plasmids were used; one which incorporates a gene that expresses red fluorescence (Cy3) and another that expresses green (GFP) fluorescence protein. Five months later, the four sheep gave birth to six lambs (two with sets of twins). The four ewes that where inseminated with treated spermatozoa gave birth to GM lambs that showed green fluorescence under UV light exposure. The two lambs of the control sheep were negative under the same illumination. It was concluded that spermatozoa, properly treated with both plasmids, were effective vectors for incorporating and integrating the transgene into the resulting genome of embryos and viable born individuals. This work was presented at the international joint conference of the European Embryo Transfer Association and the Brazilian Society of Embryo Technology in August-September 2016.El objetivo de nuestro trabajo fue incrementar la cantidad de embriones y animales de granja adultos reproductivamente viables y genéticamente modificados que se logran por “transferencia de genes mediada por espermatozoides” (TGME). Actualmente resultan escasos los avances en este ámbito, pues las técnicas vigentes son muy costosas y de bajo rendimiento. A partir de los resultados logrados con la técnica Fecundación In Vitro (FIV) de ovocitos obtenidos a partir de ovarios de frigorífico, se desarrolló un protocolo que aplica la técnica SMGT por medio de Inseminación Artificial Laparoscópica (IAUL) con semen tratado en ovejas sincronizadas y superovuladas. Con este fin, 4 ovejas frisonas adultas fueron sometidas a tratamientos hormonales para lograr celos multiovulatorios en fechas prediseñadas. De las cuatro ovejas, todas fueron inseminadas por IAUL, una con semen sin tratamiento (testigo) y tres con semen tratado. Siete días más tarde una de las ovejas inseminadas con semen tratado produjo 9 óvulos, tres de ellos fecundados con diferente estatus de multiplicación celular. Los tres embriones expresaron en todas sus blastómeras los plásmidos incorporados por el esperma tratado. Ninguno de los ovocitos no fecundados evidenció fluorescencia roja o verde. Se utilizaron dos plásmidos, uno que incorpora un gen que expresa una proteína de fluorescencia color rojo (Cy3) y otra que expresa color verde (GFP). Cinco meses más tarde las cuatro ovejas parieron seis corderos (dos con mellizos). Los cuatro corderos de las ovejas inseminadas con espermatozoides tratados resultaron genéticamente modificados, y evidenciaron fluorescencia verde al ser iluminados con luz UV. Los dos corderos de la oveja testigo resultaron negativos bajo la misma iluminación. Se concluyó que los espermatozoides, apropiadamente tratados con ambos plásmidos, resultaron vectores eficaces para incorporar e integrar el transgen en el genoma resultante de los embriones y de los individuos nacidos viables. Este trabajo fue presentado en las jornadas conjuntas de la Asociación Europea de Transferencia de Embriones y de la Sociedad Brasilera de Tecnología de Embriones en agosto-septiembre de 2016

Expresión plasmídica heteróloga en embriones ovinos obtenidos por fertilización in vitro usando el espermatozoide como vector

Los resultados en la obtención de animales de granja genéticamente modificados (AGGM), no están aún a la altura de las expectativas científicas. A nivel mundial, los AGGM patentados y funcionales son muy escasos. Esta lentitud en resultados medido en términos de AGGM nacidos, reproductivamente viables por ensayo, es asignada al bajo rendimiento de las técnicas utilizadas, su costo elevado y el riesgo asociado a la bioseguridad. La hipótesis de trabajo fue que el espermatozoide fértil e intacto, de vertebrados mamíferos superiores, es capaz de portar ADN heterólogo y durante el acto de la fecundación, sea in-vitro o in-vivo, integrarlo funcionalmente al genoma del cigoto. Consecuentemente, será posible su expresión en los blastómeros del embrión y las células diferenciadas del organismo adulto. Asimismo, se postuló que los resultados medidos en términos de tasa de ensayo/éxito de esta técnica superan ampliamente a las otras técnicas utilizadas. Se lograron generar embriones ovinos por fecundación in-vitro (FIV) de acuerdo a los parámetros del tratamiento del espermatozoide (SPZ) previamente establecidos. Para lograr este objetivo se utilizaron 48 complejos cumulus ovocito (CCOs) provenientes de 35 tractos genitales ovinos de matadero, cultivados y madurados in-vitro. Dos muestras, una tratada con semen tratado y la otra (control) con semen no tratado, fueron puestas a fertilizar. Luego de la fertilización y cultivo los embriones fueron retirados y observados bajo microscopia microcaptura láser fluorescente (LCM) y con focal de fluorescencia. Si bien la muestra control debió ser descartada al momento de la observación por excesiva fibrinosis, en la muestra tratada pudieron observarse 11 blastocistos expandidos con intensa señal de fluorescencia en todas las blastómeros, 6 ovocitos no fertilizadosy 4 embriones malformados que no presentaron señal bajo luz fluorescente. Se consideró testigo a los ovocitos no fertilizados que no presentaron fluorescencia alguna; y se los estimó como evidencia válida para demostrar la transfección realizada por parte del SPZ. Solo aquellos que fueron fecundados, y en este caso la totalidad (100%), evidenciaron fluorescencia en todas las blastómeros en las diferentes muestras.Production of genetically modified farm animals (GMFA) is not yet up to scientific expectations.This slowness results measured in terms of GMFA born, reproductively viable (“founders”) by trial, is assigned to the very low yield of the techniques used to incorporate gene constructs, therefore, high cost and bio-security risk of some of them. Our hypothesis, was that properly treated, fertile and intact mammalian sperm is capable of carrying heterologous DNA, and, during the act of fecundation, either in-vitro or in-vivo, functionally integrate it into the resulting zygote genome, allowing subsequent expression in embryo blastomeres and differentiated cells of the adult organism, and, that the results measured as test rate / success of this technique, far outweigh other techniques used with the same objective. As specific goals we proposed and developed sheep embryos from In-Vitro Fertilization (IVF) according to the parameters of sperm treatment (SPZ) previously established. To achieve this goal 48 Cumulus Oocyte Complex (COCs) was isolated from 35 slaughter-house ovine genital tracts, grown and matured in-vitro as described above. Two oocytes samples, one with semen treated and the other (control) with untreated sperm, are submitted to a fecundation. After fertilization and culture, embryos are removed and observed under fluorescent microscopy microcapture laser (LCM) and fluorescence confocal. While the control sample should be discarded at the time of observation by excessive fibrinosis, treated sample revealed 11 expanded blastocysts with intense fluorescence signal in all blastomeres, 6 unfertilized oocytes and 4 malformed embryos showingno signal under fluorescent light.It is considered as control unfertilized oocytes who did not show any fluorescence as valid evidence to prove the transfection carried out by the SPZ, since only those who were fertilized, in this case all (100%) evidenced strong fluorescence signal in all blastomeres in different samples

Prospective Latin American cohort evaluating outcomes of patients with COVID-19 and abnormal liver tests on admission

Introduction & objectives: The independent effect of liver biochemistries as a prognostic factor in patients with COVID-19 has not been completely addressed. We aimed to evaluate the prognostic value of abnormal liver tests on admission of hospitalized patients with COVID-19. Materials & methods: We performed a prospective cohort study including 1611 hospitalized patients with confirmed SARS-CoV-2 infection from April 15, 2020 through July 31, 2020 in 38 different Hospitals from 11 Latin American countries. We registered clinical and laboratory parameters, including liver function tests, on admission and during hospitalization. All patients were followed until discharge or death. We fit multivariable logistic regression models, further post-estimation effect through margins and inverse probability weighting. Results: Overall, 57.8% of the patients were male with a mean age of 52.3 years, 8.5% had chronic liver disease and 3.4% had cirrhosis. Abnormal liver tests on admission were present on 45.2% (CI 42.7–47.7) of the cohort (n = 726). Overall, 15.1% (CI 13.4–16.9) of patients died (n = 244). Patients with abnormal liver tests on admission presented higher mortality 18.7% (CI 15.9–21.7), compared to those with normal liver biochemistries 12.2% (CI 10.1–14.6); P 30. Conclusions: The presence of abnormal liver tests on admission is independently associated with mortality and severe COVID-19 in hospitalized patients with COVID-19 infection and may be used as surrogate marker of inflammation.Fil: Mendizabal, Manuel. Universidad Austral. Hospital Universitario Austral; ArgentinaFil: Piñero, Federico. Universidad Austral. Hospital Universitario Austral; ArgentinaFil: Ridruejo, Ezequiel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. CEMIC-CONICET. Centro de Educaciones Médicas e Investigaciones Clínicas "Norberto Quirno". CEMIC-CONICET; ArgentinaFil: Anders, Margarita. Hospital Aleman; ArgentinaFil: Silveyra, María Dolores. Sanatorio Anchorena; ArgentinaFil: Torre, Aldo. Centro Médico ABC; MéxicoFil: Montes, Pedro. Hospital Nacional Daniel A. Carrión; PerúFil: Urzúa, Alvaro. Hospital Clínico de la Universidad de Chile; ChileFil: Pages, Josefina. Universidad Austral. Hospital Universitario Austral; ArgentinaFil: Toro, Luis G.. Hospitales de San Vicente Fundación de Medellín y Rionegro; ColombiaFil: Díaz, Javier. Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins; PerúFil: Gonzalez Ballerga, Esteban. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Hospital de Clínicas General San Martín; ArgentinaFil: Miranda Zazueta, Godolfino. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición; MéxicoFil: Peralta, Mirta. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital de Infecciosas "Dr. Francisco Javier Muñiz"; ArgentinaFil: Gutiérrez, Isabel. Centro Médico ABC; MéxicoFil: Michelato, Douglas. Hospital Especializado en Enfermedades Infecciosas Instituto Couto Maia; BrasilFil: Venturelli, Maria Grazia. Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen; PerúFil: Varón, Adriana. Fundación Cardio-Infantil; ColombiaFil: Vera Pozo, Emilia. Hospital Regional Dr. Teodoro Maldonado Carbo; EcuadorFil: Tagle, Martín. Clínica Anglo-Americana; PerúFil: García, Matías. Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas "Norberto Quirno"; ArgentinaFil: Tassara, Alfredo. Hospital Aleman; ArgentinaFil: Brutti, Julia. Sanatorio Anchorena; ArgentinaFil: Ruiz García, Sandro. Hospital de Víctor Lazarte Echegaray; PerúFil: Bustios, Carla. Clínica Delgado; PerúFil: Escajadillo, Nataly. Hospital Nacional Almanzor Aguinaga Asenjo; PerúFil: Macias, Yuridia. No especifíca;Fil: Higuera de la Tijera, Fátima. Hospital General de México “Dr. Eduardo Liceaga"; MéxicoFil: Gómez, Andrés J.. Hospital Universitario Fundación Santa Fé de Bogotá; ColombiaFil: Dominguez, Alejandra. Hospital Padre Hurtado; ChileFil: Castillo Barradas, Mauricio. Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional La Raza; MéxicoFil: Contreras, Fernando. No especifíca;Fil: Scarpin, Aldana. Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas "Norberto Quirno"; ArgentinaFil: Schinoni, Maria Isabel. Hospital Alianza; BrasilFil: Toledo, Claudio. Universidad Austral de Chile; ChileFil: Girala, Marcos. Universidad Nacional de Asunción; ParaguayFil: Mainardi, Victoria. Hospital Central De las Fuerzas Armadas; UruguayFil: Sanchez, Abel. Hospital Roosevelt; GuatemalaFil: Bessone, Fernando. Provincia de Santa Fe. Ministerio de Salud y Medio Ambiente - Rosario. Hospital Provincial del Centenario; ArgentinaFil: Rubinstein, Fernando Adrian. Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Silva, Marcelo Oscar. Universidad Austral. Hospital Universitario Austral; Argentin