Estresse oxidativo renal em ratos submetidos à hiper-homocisteinemia

O estresse oxidativo tem sido considerado parte importante na etiopatogenia das alterações cardiovasculares e cerebrais causadas pela hiper-homocisteinemia (HHcy), uma condição caracterizada por elevados níveis plasmáticos de homocisteína (Hcy), um aminoácido derivado da metionina. A HHcy leve ocorre quando os níveis plasmáticos de Hcy variam de 15 a 30 µmol/L e pode resultar da deficiência de ácido fólico, vitamina B6 e/ou vitamina B12. A HHcy severa é caracterizada por níveis plasmáticos de Hcy superiores a 100 µmol/L e é encontrada na homocistinúria (HCU) clássica, um erro inato do metabolismo caracterizado pela deficiência da enzima cistationina β-sinatse (CBS), que catalisa a via de transulfuração da Hcy. Visto que estudos mais recentes demonstram que a HHcy também está associada a um comprometimento da função renal, a hipótese deste trabalho é que o estresse oxidativo também esteja envolvido nas alterações renais causadas pela Hcy. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito da administração de Hcy sobre a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO), lipoperoxidação, dano às proteínas e formação de óxido nítrico (NO), além de avaliar as defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas em rins de ratos. Visando testar a hipótese de que as possíveis mudanças no status oxidativo/nitrativo nos rins de ratos hiperhomocisteinêmicos poderiam levar à nefropatia, também se verificaram parâmetros séricos de função renal, tais como creatinina, uréia, ácido úrico e albumina. Ratos Wistar foram submetidos a modelos experimentais de HHcy leve e severa desenvolvidos em nosso grupo de pesquisa. No modelo experimental de HHcy leve crônica, ratos adultos receberam injeções subcutâneas diárias de Hcy do 30º ao 60º dia de vida. A dose utilizada foi de 0,03 µmol Hcy/g de peso corporal e induzia concentrações plasmáticas de Hcy d No modelo experimental de HHcy severa crônica, ratos neonatos receberam injeções subcutâneas diárias de Hcy do 6o ao 28o dia de vida. As doses utilizadas foram de 0,3 a 0,6 µmol Hcy/g de peso corporal e elevavam as concentrações plasmáticas de Hcy para cerca de 500μM. O grupo controle recebeu salina e os animais foram decapitados 1 ou 12 horas após a última injeção. Os resultados obtidos a partir do modelo de HHcy leve demonstram que a administração crônica de Hcy aumentou as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) e a produção de NO (medida através dos níveis de nitritos) nos rins, assim como reduziu os níveis de albumina no soro dos animais 12 horas após a última injeção. A indução de HHcy leve aguda aumentou os níveis de diclorofluoresceína (DCF) e de nitritos em rins de ratos 1 hora após a injeção. Os resultados do modelo de HHcy severa crônica mostram um aumento significativo dos níveis de DCF e de substância reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) 1 e 12 horas após a última injeção, sugerindo que a Hcy aumentou os níveis de ERO e a lipoperoxidação em rins de ratos, respectivamente. O aumento da atividade da SOD e a redução da atividade da CAT também foram observados em 1 e 12 horas. Por outro lado, a redução das defesas antioxidantes não enzimáticas e o aumento dos níveis de nitritos foram observados somente 1 hora após a última administração de Hcy. A administração crônica de altas doses do aminoácido ainda elevou os níveis de uréia e reduziu os níveis de albumina 12 horas após a última injeção. Tais achados demonstram uma ligação entre a HHcy leve e severa e o estresse oxidativo em rins, o que pode representar, pelo menos em parte, um dos importantes mecanismos que contribuem para o risco de dano renal durante a HHcy.Oxidative stress has been considered an important part in the etiopathogenesis of cardiovascular and brain changes caused by hyperhomocysteinemia (HHcy), a condition characterized by elevated plasma levels of homocysteine (Hcy), an amino acid derived from methionine. Mild HHcy occurs when Hcy plasma levels range from 15 to 30 µmol/L and may result from deficiency of folic acid, vitamin B6 and/or vitamin B12. Severe HHcy is characterized by plasma Hcy levels above 100 µmol/L and is found in classical homocystinuria (HCU), an inborn error of metabolism characterized by a deficiency of the enzyme cystathionine β-sinatse (CBS), which catalyzes the Hcy transsulfuration pathway. Since recent studies demonstrate that HHcy is also associated with impaired renal function, the hypothesis of this study is that oxidative stress is also involved in the renal changes caused by Hcy. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of Hcy administration on the formation of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation, protein damage and formation of nitric oxide (NO), in addition to evaluating the enzymatic and nonenzymatic antioxidant defenses in rat kidneys. To test the hypothesis that possible changes in oxidative/nitrative status in kidneys of hyperhomocysteinemic rats could lead to renal failure, serum parameters of renal function (creatinine, urea, uric acid and albumin) were also tested. Rats were subjected to experimental models of mild and severe HHcy developed in our research group. In the experimental model of chronic mild HHcy, adult rats received daily subcutaneous injection of Hcy from the 30th to the 60th day-of-age. The dose was 0.03 µmol Hcy/g body weight and induced plasma Hcy levels of about 30μM. The control group received saline and the animals were decapitated 12 hours after the last injection. An experimental model of acute mild HHcy was also performed and was induced by a single subcut The doses used were 0.3 to 0.6 µmol Hcy/g body weight and elevated plasma concentrations of Hcy to about 500μM. The control group received saline and the animals were decapitated 1 or 12 hours after the last injection. The results obtained from the model of mild HHcy demonstrate that chronic Hcy administration increased superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities and NO production (measured as nitrite levels) in kidneys, as well as reduced serum albumin levels at 12 hours after the last injection. Induction of acute mild HHcy increased dichlorofluorescein (DCF) and nitrite levels in rat kidneys at 1 hour after injection. The results of the model of chronic severe HHcy show a significant increase in DCF and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) levels at 1 and 12 hours after the last injection, suggesting that Hcy increased ROS levels and lipid peroxidation in rat kidneys, respectively. The increase in SOD activity and the reduction in CAT activity were also observed at 1 and 12 hours. Moreover, the reduction of nonenzymatic antioxidant defenses and increase in nitrite levels were only observed at 1 hour after the last administration of Hcy. The chronic administration of high doses of the amino acid still increased urea levels and decreased albumin levels at 12 hours after the last injection. These findings demonstrate a link between severe and mild HHcy and oxidative stress in the kidneys, which may represent, at least in part, one of the important mechanisms that contribute to the risk of kidney damage during HHcy

Alterações bioquímicas, moleculares, histológicas e comportamentais na prole de ratas Wistar submetidas à hipermetioninemia gestacional

A hipermetioninemia é uma condição caracterizada por altos níveis de metionina no sangue e em outros tecidos, podendo causar danos neurológicos, hepáticos e musculares. Considerando que a placenta transfere a metionina do sangue materno para a circulação fetal e que pouco se sabe sobre o efeito da hipermetioninemia gestacional sobre o feto em desenvolvimento, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo animal de hipermetioninemia materna quimicamente induzido em ratas e utilizar o mesmo para investigar parâmetros bioquímicos (estresse oxidativo, atividade da Mg2+-ATPase, atividade e imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase, número de neurônios, níveis de neurotrofinas, metabolismo energético, inflamação e apoptose), moleculares (expressão gênica da Na+,K+-ATPase) e histológicos (microscopia eletrônica) nos encéfalos da prole, bem como avaliar tarefas comportamentais (campo aberto, esquiva inibitória e reconhecimento de objetos). Também analisamos parâmetros de estresse oxidativo/nitrosativo no músculo esquelético e parâmetros de dano muscular e inflamação no soro da prole. A hipermetioninemia foi induzida em ratas através de duas injeções subcutâneas diárias de metionina durante todo o período gestacional. Um grupo de ratas recebeu a dose 1 (1,34 μmol/g peso corporal) e outro recebeu a dose 2 (2,68 μmol/g peso corporal). O grupo controle recebeu salina. Após o nascimento, um grupo de filhotes foi eutanasiado no sétimo dia de vida e outro grupo foi eutanasiado aos 21 dias. Ambas as doses aumentaram os níveis encefálicos de metionina das mães e a dose 2 aumentou os níveis de metionina nos encéfalos da prole. Após estabelecer o modelo, a dose 2 de metionina foi escolhida para estudar os efeitos do tratamento sobre a prole. Os testes bioquímicos subsequentes foram realizados nos filhotes de 21 dias, a histologia foi realizada na prole de 21 e 30 dias e os testes comportamentais foram realizados em filhotes de 30 dias. Os resultados demonstraram que a hipermetioninemia materna reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase, Mg2+- ATPase, catalase e complexo II/succinato desidrogenase, o conteúdo de sulfidrilas, número de neurônios e níveis de NGF e BDNF, bem como aumentou os níveis de RNAm e imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase nos encéfalos dos filhotes. Foram observados também alterações morfológicas, indicativas de degeneração celular nos neurônios da prole, e os testes comportamentais indicaram deficit de memória. Com relação aos danos musculares, houve um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e lipoperoxidação e uma redução do conteúdo de sulfidrilas, atividades das enzimas antioxidantes e nos níveis de nitritos no músculo esquelético da prole. A atividade da creatina cinase foi reduzida e os níveis de ureia e proteína C reativa foram aumentados no soro. Esses resultados foram acompanhados por perda de massa muscular. Tais achados mostraram que a hipermetioninemia gestacional induziu alterações bioquímicas, moleculares e histológicas no encéfalo e bioquímicas no músculo esquelético e soro dos filhotes, as quais podem contribuir para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos danos neurológicos e musculares causados por essa condição. Ressaltamos a importância do desenvolvimento do referido modelo de hipermetioninemia gestacional que além de ampliar o entendimento da toxicidade de altos níveis metionina, também abriu perspectivas para novos estudos a respeito dos efeitos ocasionados pela exposição ao excesso de metionina devido a uma condição genética ou uma dieta rica em proteína durante a vida pré-natal.Hypermethioninemia is a condition characterized by elevated levels of methionine in blood and other tissues and may cause neurological, hepatic and muscular damages. Considering that placenta transfers methionine from maternal blood to the fetal circulation and little is known about the effect of gestational hypermetioninemia on the developing fetus, the main objective of this work was to develop a chemically induced animal model of maternal hypermethioninemia in rats and to use it to investigate biochemical (oxidative stress, activity of Mg2+-ATPase, activity and immunocontent of Na+,K+-ATPase, number of neurons, neurotrophins levels, energy metabolism, inflammation, and apoptosis), molecular (gene expression of Na+,K+-ATPase) and histological parameters (electron microscopy) in encephalon of the offspring, as well as evaluate behavioral tasks (open field, inhibitory avoidance and object recognition). We also analyzed oxidative/nitrosative stress parameters in skeletal muscle and parameters of muscle damage and inflammation in serum of the offspring. Hypermethioninemia was induced in rats through two daily subcutaneous injections of methionine throughout the gestational period. A group of pregnant rats received dose 1 (1.34 μmol/g body weight) and the other received dose 2 (2.68 μmol/g body weight). The control group received saline. After birth, a first group of pups was euthanized at the 7th day of life and the second group at the 21st day of life. Both doses 1 and 2 increased methionine levels in the brain of the mother rats and dose 2 increased methionine levels in encephalon of the offspring. After establishing the experimental model, the highest dose of methionine was chosen to study the effects of treatment on offspring. The subsequent biochemical tests were performed on 21-day-old pups, histological analyses were performed on offspring of 21 and 30 days of age, and behavioral tests were performed on 30-day-old pups. The results demonstrated that maternal hypermethioninemia reduced Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase, catalase and complex II/succinate dehydrogenase activities, sulfhydryl content, number of neurons and levels of NGF and BDNF, as well as increased levels of mRNA and immunocontent of Na+,K+-ATPase in the brains of the pups. Morphological changes indicative of cellular degeneration were also observed in offspring neurons, and behavioral tests indicated memory deficit. With regard to muscle damage, there was an increase in the production of reactive oxygen species and lipoperoxidation, and a reduction of the sulfhydryl content, antioxidant enzymes activities and in the levels of nitrites in skeletal muscle of the offspring. Creatine kinase activity was reduced and urea and C-reactive protein levels were increased in serum. These results were accompanied by loss of muscle mass. These findings showed that gestational hypermethioninemia induced biochemical, molecular and histological changes in the brain and biochemical changes in skeletal muscle and serum of pups, which may contribute to the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in the neurological and muscular damages caused by this condition. We emphasize the importance of the development of this model of gestational hypermetioninemia that, in addition to increasing the understanding of toxicity of high methionine levels, also opened perspectives for new studies regarding the effects caused by exposure to excess methionine due to a genetic condition or a diet rich in protein during prenatal life

Alterações bioquímicas, moleculares, histológicas e comportamentais na prole de ratas Wistar submetidas à hipermetioninemia gestacional

A hipermetioninemia é uma condição caracterizada por altos níveis de metionina no sangue e em outros tecidos, podendo causar danos neurológicos, hepáticos e musculares. Considerando que a placenta transfere a metionina do sangue materno para a circulação fetal e que pouco se sabe sobre o efeito da hipermetioninemia gestacional sobre o feto em desenvolvimento, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo animal de hipermetioninemia materna quimicamente induzido em ratas e utilizar o mesmo para investigar parâmetros bioquímicos (estresse oxidativo, atividade da Mg2+-ATPase, atividade e imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase, número de neurônios, níveis de neurotrofinas, metabolismo energético, inflamação e apoptose), moleculares (expressão gênica da Na+,K+-ATPase) e histológicos (microscopia eletrônica) nos encéfalos da prole, bem como avaliar tarefas comportamentais (campo aberto, esquiva inibitória e reconhecimento de objetos). Também analisamos parâmetros de estresse oxidativo/nitrosativo no músculo esquelético e parâmetros de dano muscular e inflamação no soro da prole. A hipermetioninemia foi induzida em ratas através de duas injeções subcutâneas diárias de metionina durante todo o período gestacional. Um grupo de ratas recebeu a dose 1 (1,34 μmol/g peso corporal) e outro recebeu a dose 2 (2,68 μmol/g peso corporal). O grupo controle recebeu salina. Após o nascimento, um grupo de filhotes foi eutanasiado no sétimo dia de vida e outro grupo foi eutanasiado aos 21 dias. Ambas as doses aumentaram os níveis encefálicos de metionina das mães e a dose 2 aumentou os níveis de metionina nos encéfalos da prole. Após estabelecer o modelo, a dose 2 de metionina foi escolhida para estudar os efeitos do tratamento sobre a prole. Os testes bioquímicos subsequentes foram realizados nos filhotes de 21 dias, a histologia foi realizada na prole de 21 e 30 dias e os testes comportamentais foram realizados em filhotes de 30 dias. Os resultados demonstraram que a hipermetioninemia materna reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase, Mg2+- ATPase, catalase e complexo II/succinato desidrogenase, o conteúdo de sulfidrilas, número de neurônios e níveis de NGF e BDNF, bem como aumentou os níveis de RNAm e imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase nos encéfalos dos filhotes. Foram observados também alterações morfológicas, indicativas de degeneração celular nos neurônios da prole, e os testes comportamentais indicaram deficit de memória. Com relação aos danos musculares, houve um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e lipoperoxidação e uma redução do conteúdo de sulfidrilas, atividades das enzimas antioxidantes e nos níveis de nitritos no músculo esquelético da prole. A atividade da creatina cinase foi reduzida e os níveis de ureia e proteína C reativa foram aumentados no soro. Esses resultados foram acompanhados por perda de massa muscular. Tais achados mostraram que a hipermetioninemia gestacional induziu alterações bioquímicas, moleculares e histológicas no encéfalo e bioquímicas no músculo esquelético e soro dos filhotes, as quais podem contribuir para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos danos neurológicos e musculares causados por essa condição. Ressaltamos a importância do desenvolvimento do referido modelo de hipermetioninemia gestacional que além de ampliar o entendimento da toxicidade de altos níveis metionina, também abriu perspectivas para novos estudos a respeito dos efeitos ocasionados pela exposição ao excesso de metionina devido a uma condição genética ou uma dieta rica em proteína durante a vida pré-natal.Hypermethioninemia is a condition characterized by elevated levels of methionine in blood and other tissues and may cause neurological, hepatic and muscular damages. Considering that placenta transfers methionine from maternal blood to the fetal circulation and little is known about the effect of gestational hypermetioninemia on the developing fetus, the main objective of this work was to develop a chemically induced animal model of maternal hypermethioninemia in rats and to use it to investigate biochemical (oxidative stress, activity of Mg2+-ATPase, activity and immunocontent of Na+,K+-ATPase, number of neurons, neurotrophins levels, energy metabolism, inflammation, and apoptosis), molecular (gene expression of Na+,K+-ATPase) and histological parameters (electron microscopy) in encephalon of the offspring, as well as evaluate behavioral tasks (open field, inhibitory avoidance and object recognition). We also analyzed oxidative/nitrosative stress parameters in skeletal muscle and parameters of muscle damage and inflammation in serum of the offspring. Hypermethioninemia was induced in rats through two daily subcutaneous injections of methionine throughout the gestational period. A group of pregnant rats received dose 1 (1.34 μmol/g body weight) and the other received dose 2 (2.68 μmol/g body weight). The control group received saline. After birth, a first group of pups was euthanized at the 7th day of life and the second group at the 21st day of life. Both doses 1 and 2 increased methionine levels in the brain of the mother rats and dose 2 increased methionine levels in encephalon of the offspring. After establishing the experimental model, the highest dose of methionine was chosen to study the effects of treatment on offspring. The subsequent biochemical tests were performed on 21-day-old pups, histological analyses were performed on offspring of 21 and 30 days of age, and behavioral tests were performed on 30-day-old pups. The results demonstrated that maternal hypermethioninemia reduced Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase, catalase and complex II/succinate dehydrogenase activities, sulfhydryl content, number of neurons and levels of NGF and BDNF, as well as increased levels of mRNA and immunocontent of Na+,K+-ATPase in the brains of the pups. Morphological changes indicative of cellular degeneration were also observed in offspring neurons, and behavioral tests indicated memory deficit. With regard to muscle damage, there was an increase in the production of reactive oxygen species and lipoperoxidation, and a reduction of the sulfhydryl content, antioxidant enzymes activities and in the levels of nitrites in skeletal muscle of the offspring. Creatine kinase activity was reduced and urea and C-reactive protein levels were increased in serum. These results were accompanied by loss of muscle mass. These findings showed that gestational hypermethioninemia induced biochemical, molecular and histological changes in the brain and biochemical changes in skeletal muscle and serum of pups, which may contribute to the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in the neurological and muscular damages caused by this condition. We emphasize the importance of the development of this model of gestational hypermetioninemia that, in addition to increasing the understanding of toxicity of high methionine levels, also opened perspectives for new studies regarding the effects caused by exposure to excess methionine due to a genetic condition or a diet rich in protein during prenatal life

盈餘與股價報酬關係再檢定

　　理論上盈餘和股價具有關係是不爭的事實，國外的研究多數支持此種現象，而且二者反應的關係有盈餘宣告日之前反應及盈餘宣告日後遲延反應(Post Earning Drift)二種，然而對此方面國內的研究結果並不穩定。　　為了進一步探討盈餘是否有用？且其有用的程度如何？本研究乃使用關聯性研究法(Association Study)，並參酌Collins and Kothrri (1989), Bernard and Thomas (1989), Easton and Harris (1991), Beaver Lambert and Morse (1980), Beaver. Lambert and Ryan (1987)，建立九項假設，並採用日報酬（盈餘宣告日前後30日的窗期）及週報酬（盈餘宣告日前後三個月、六個月、九個月的窗期）用以確認盈餘的有用性。經以民國76年至83年，75家國內上市公司為樣本進行分析，結果發現：　　採BLM及BLR修正Easton and Harrisr的模，盈餘資訊在我國股市中大多數使用期間在盈餘宣告日前30日及六個月兩段期間，且盈餘水準比諸盈餘成長水準（即未預期盈餘）更為市場所重視，此結果與Bastom and Harris所預期及實證結果相若，因此推論今後評估盈餘與股價關係時至少應加入盈餘水準變數，至於所有模式的Adj R2值都不穩定