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Solid state NMR spectroscopy on the ABC-transporter ArtMP-J from G. stearothermophilus
Die ATP-binding cassette-Transporter (ABC-Transporter) nutzen die Energie aus
der ATP-Hydrolyse für die unidirektionale Translokation verschiedenster
Substrate über biologische Membranen. Auf Grund ihrer bedeutenden Rolle in
physiologischen und pathophysiologischen zellulären Prozessen ist die
Aufklärung ihres komplexen molekularen Mechanismus der Substrattranslokation
von großem medizinischem Interesse. In der vorliegenden Arbeit werden
verschiedene Konzepte zur strukturellen Charakterisierung des ABC-
Transportsystems ArtMP-J aus G. stearothermophilus mittels Festkörper-NMR-
Spektroskopie beschrieben, die als Grundlage für weiterführende NMR-Studien zu
Struktur und Dynamik des Transporters dienen sollen. Der große Vorteil dieser
Technik beruht darauf, dass Membranproteine in einer nativen Lipidumgebung
strukturell und dynamisch untersucht werden können. ArtMP-J ist für den Import
polarer Aminosäuren über die Zytoplasmamembran verantwortlich. Das
langfristige Ziel ist die strukturelle und dynamische Charakterisierung des
gesamten Transportkomplexes, eingebettet in seine native Lipidumgebung. Für
eine bessere Differenzierung zwischen den NMR-Signalen von ArtP und ArtM im
Proteinkomplex wurde ArtMP so präpariert, dass der Komplex aus einer
markierten und einer unmarkierten Untereinheit zusammengesetzt ist. Hierzu
wurden Methoden zur Herstellung und Assemblierung der einzelnen Untereinheiten
zu einem intakten Transportkomplex etabliert. So wurde die Präparation einer
stabilen NMR-Probe, die aus markiertem ArtP und unmarkiertem ArtM besteht und
in Lipide aus G. stearothermophilus eingebettet ist, ermöglicht. Die
Nukleotidbindedomäne ArtP wurde isoliert (3D-Kristalle) sowie im
Transmembrankomplex ArtM(P) (2D-Kristalle) in verschiedenen nukleotid-
gebundenen Zuständen mittels 13C-13C- Korrelationsexperimenten untersucht,
wobei die Proteine selektiv mit den Aminosäuren Threonin, Tyrosin und Prolin
(TYP) 13C, 15N-markiert waren. Parallel dazu wurden 1H-detektierte Festkörper-
NMR-Techniken zur strukturellen Untersuchung von ArtP und ArtMP angewendet.
Hierfür wurde ein Präparationsprotokoll zur Herstellung von [15N, 13C,
2H/1H]-markiertem ArtPDCN etabliert. Die hoch aufgelösten Festkörper-INEPT-
Spektren von ArtM(PDCN) zeigten gute Übereinstimmung mit dem 1H-15N-Lösungs-
NMR-Spektrum von ArtPDCN, so dass die Zuordnung einzelner Signale auf die
Festkörper-NMR-Spektren übertragen werden konnte. Es konnten mittels 13C-13C-
als auch 1H-15N-Korrelationsexperimenten gezeigt werden, dass sich die
Konformation von ArtP in 3D-Kristallen von der im Komplex ArtM(P) in nativen
Lipiden unterscheidet. Davon zeigten die Aminosäurereste Gly 197/212 und Leu
14 unterschiedliche chemische Verschiebungen in den Spektren von ArtM(PDCN)
ohne bzw. mit Nukleotid. Zukünftig sollten Untersuchungen an den einzelnen
Untereinheiten des intakten Transportkomplexes in nativen Lipiden durchgeführt
werden, um Struktur und Funktion von ArtMP nahe an seinem nativen Zustand zu
charakterisieren.ATP-binding cassette transporters are found in all three domains of life. They
energize the unidirectional substrate transport across biological membranes by
ATP hydrolysis and are involved in many physiological and pathophysiological
processes in cells. Therefore it is of high medical interest to elucidate
their molecular mechanism of substrate translocation. This thesis describes
different concepts for structural characterization of the ABC transporter
ArtMP-J from G. stearothermophilus by solid-state NMR spectroscopy. These
approaches exhibit the basis for further NMR studies to shed light on
structural and dynamic properties of the ABC transporter. Solid-state NMR
spectroscopy enables the structural investigation of membrane proteins in a
native-like environment. ArtMP-J is responsible for the transport of amino
acids across the cytoplasmic membrane. The long-term goal is the structural
and dynamic characterization of the active transport complex ArtMP embedded in
its native lipid environment by solid-state NMR spectroscopy. For this reason
ArtMP should be composed of a labeled and an unlabeled subunit in order to
reduce the number of signals and to differentiate between signals from ArtM
and ArtP. Therefore preparation protocols for the separate production of ArtM
and the assembly of the isolated subunits to an active transport complex were
established. This approach enabled the preparation of stable NMR samples of
ArtMP composed of isotopically labeled ArtP and unlabeled ArtM reconstituted
in lipids from G. stearothermophilus. The nucleotide-binding domain ArtP was
investigated as an isolated subunit (3D crystals) and in the transmembrane
complex ArtM(P) (2D-crystals) with different nucleotides by 13C-13C-
correlation experiments. ArtP was labeled selectively with the amino acids
[13C, 15N]-threonine, -tyrosine and -proline (TYP). In a further approach it
was tested whether proton detected solid-state NMR techniques are suitable for
structural studies of ArtM(P). For this purpose it was necessary to label
ArtMP and ArtP with the isotopes 15N, 13C, 2H. The high resolution spectrum of
ArtM(PDCN) superimposed well with the 1H-15N-solution-state spectrum of
ArtPDCN. So it was possible to transfer the assignment of some signals to the
solid-state spectra. It turned out that glycine 197/212 and leucine 14 were
sensitive to conformational changes by nucleotide binding in ArtP. 13C-13C –
and 1H-15N-correlation experiments have shown that the conformation of
isolated ArtP in 3D crystals differs from the complex ArtM(P) in native
lipids. For this reason structural and functional investigations of the
subunits ArtM and ArtP should be carried out in an active complex, which is
reconstituted in native lipids
Variability and conservation of structural domains in divide-and-conquer approaches
International audienc
Flexible-to-rigid transition is central for substrate transport in the ABC transporter BmrA from Bacillus subtilis
International audienceATP-binding-cassette (ABC) transporters are molecular pumps that translocate molecules across the cell membrane by switching between inward-facing and outward-facing states. To obtain a detailed understanding of their mechanism remains a challenge to structural biology, as these proteins are notoriously difficult to study at the molecular level in their active, membrane-inserted form. Here we use solid-state NMR to investigate the multidrug ABC transporter BmrA reconstituted in lipids. We identify the chemical-shift differences between the inward-facing, and outward-facing state induced by ATP:Mg 2+ :Vi addition. Analysis of an X-loop mutant, for which we show that ATPase and transport activities are uncoupled, reveals an incomplete transition to the outward-facing state upon ATP:Mg 2+ :Vi addition, notably lacking the decrease in dynamics of a defined set of residues observed in wild-type BmrA. This suggests that this stiffening is required for an efficient transmission of the conformational changes to allow proper transport of substrate by the pump
Efficient and stable reconstitution of the ABC transporter BmrA for solid-state NMR studies
Affiliations ECOFECTInternational audienc
Solid-state NMR chemical-shift perturbations indicate domain reorientation of the DnaG primase in the primosome of Helicobacter pylori
ISSN:0925-2738ISSN:1573-500
Solid-state NMR sequential assignments of the N-terminal domain of HpDnaB helicase
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Gradient reconstitution of membrane proteins for solid-state NMR studies
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