Crystal structure and regulation of the citrus pol III repressor MAF1 by auxin and phosphorylation

MAF1 is the main RNA polymerase (Pol) III repressor that controls cell growth in eukaryotes. The Citrus ortholog, CsMAF1, was shown to restrict cell growth in citrus canker disease but its role in plant development and disease is still unclear. We solved the crystal structure of the globular core of CsMAF1, which reveals additional structural elements compared with the previously available structure of hMAF1, and explored the dynamics of its flexible regions not present in the structure. CsMAF1 accumulated in the nucleolus upon leaf excision, and this translocation was inhibited by auxin and by mutation of the PKA phosphorylation site, S45, to aspartate. Additionally, mTOR phosphorylated recombinant CsMAF1 and the mTOR inhibitor AZD8055 blocked canker formation in normal but not CsMAF1-silenced plants. These results indicate that the role of TOR on cell growth induced by Xanthomonas citri depends on CsMAF1 and that auxin controls CsMAF1 interaction with Pol III in citrusThis work was supported by Sa˜ o Paulo Research Foundation (FAPESP grant 2011/20468-1). C.E.B. and A.F.Z.N. received a fellowship from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Peer reviewe

Structural studies of molecular chaperones by mass spectrometry

Orientador: Fábio César GozzoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: A espectrometria de massas (MS) tem sido bastante utilizada em analises de amostras biológicas, tornando uma ferramenta indispensável para pesquisas na área de proteômica. A ligação cruzada é um processo de união covalente entre dois átomos espacialmente próximas. A ligação cruzada acoplada a MS permite estudos estruturais de proteínas baseado nas restrições de distância determinadas pelos espécies inter- intra-moleculares ligadas entre as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos. Essa técnica vem sendo bastante utilizada na análise de interação entre proteínas, entretanto, um aspecto pouco explorado é a analise estrutural de proteínas. O objetivo desse trabalho foi determinar as estruturas terciárias e quaternárias de proteínas de chaperonas moleculares de cana-de-açúcar ou proteínas de choque térmico (do inglês, sugarcane heat shock protein, SHsp) utilizando a técnica de ligação cruzada acoplada com MS e modelagem molecular. As restrições de distâncias obtidas pela ligação cruzada e o gráfico de Ramanchandran foram utilizados para validar as estruturas tridimensionais da SHsp70 e SHsp90 obtidas por modelagem por homologia. Informações adicionais de dinâmica e flexibilidade da SHsp90 foi obtida pela técnica de troca hidrogênio/deutério. As chaperonas moleculares são proteínas importantes presentes em células para evitar o enovelamento incorreto de outras proteínas e suas agregações. Em plantas, fatores que corroboram com a tolerância ao estresse ainda são pouco compreendidos, mas provavelmente as chaperonas moleculares desempenha um papel importante no controle aos danos desse organismo. Desse modo, caracterizar estruturas de Hsp de cana de açúcar é uma informação essencial para a compreensão do mecanismo deste acompanhante de ação. Os estudos estruturais baseados em ligação cruzada acoplada a MS e modelagem por homologia permitiu propor um modelo estrutural para SHsp90 e SHsp70Abstract: Mass spectrometry (MS) has been extensively used to analyze biological samples and has advanced as an indispensable tool for proteomics research. Cross-linking is the process of chemically joining two spatially close atoms by covalent bond. The chemical cross-linking coupled to MS allows structural studies of protein based on distance constrains determined by inter- and intra-molecular cross-link between side chains of amino acids residues. This technique has been normally used to analyze protein-protein interaction but is mostly unexplored for structural analysis of proteins. The aim of this work was to investigate tertiary and quaternary structure of sugarcane molecular chaperone or heat shock protein (SHsp) using chemical cross-linking coupled to MS and homology modeling. The distance constrains obtained by chemical crosslinking and Ramachandran plot were used to validate tridimensional structures of SHsp70 and SHsp90 that was predicted by homology modeling. Additional information about flexibility and dynamics of SHsp90 was obtained using hydrogen/deuterium exchange (HDX) coupled to MS. The molecular chaperones are important proteins present in cell that helps prevent incorrect folding of proteins and their aggregation. The stress tolerance in plants is still poorly understood, but heat shock proteins likely play a large role in the plant damage control machinery. Thereby, characterizing Sugarcane Hsp structures is essential information toward the understanding of this chaperone¿s mechanism of action. The structural study of molecular chaperones by chemical cross-linking coupled to MS and homology modelling allowed the generation of a structural model for SHsp90 and SHsp70MestradoQuimica OrganicaMestra em Químic

Characterization of protein-protein interaction by mass spectrometry

Orientadores: Fabio Cesar Gozzo, Juliana Helena Costa SmetanaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: A técnica de ligação cruzada associada à espectrometria de massas (XL-MS) baseia-se na união covalente de resíduos de aminoácidos estruturalmente próximos por meio de um agente de ligação cruzada (ALC). O ALC atua como uma régua molecular gerando informações a respeito da distância em que os resíduos reativos encontram-se na estrutura terciária e quaternária de proteínas. A técnica de troca de hidrogênio-deutério associada à MS (HDX-MS) consiste na troca de átomos de hidrogênio lábeis por átomos de deutério presentes na solução. Essa técnica fornece informações sobre mudanças conformacionais e dinâmica de proteínas e complexos proteicos. A Hsp90 é uma chaperona molecular essencial para células que exerce um papel fundamental na homeostase. A Hsp90 atua também no processo de translocação de proteínas do citosol para as mitocôndrias via complexo TOM, por meio da interação entre os domínios C-terminal da Hsp90 (CHsp90) e o citosólico da proteína Tom70 (Tom70C). As características estruturais do complexo CHsp90-Tom70C foram investigadas utilizando XL-MS e HDX-MS. Os resultados demonstraram uma nova região de interação entre essas proteínas que envolve a hélice A7 da Tom70C e o peptídeo TLRQKAEADKNDKSVKDLVILLY presente na Hsp90. Ensaios de importações mitocondriais confirmaram essa nova região de interação. Os resultados permitiram propor um modelo estrutural de baixa resolução para o complexo CHsp90-Tom70C e ampliar as informações descritas na literatura quanto ao mecanismo de importação de pré-proteínas para mitocôndria. A PP2A, segundo alvo desta tese, é uma serina/treonina fosfatase que atua em diversos processos celulares e é um importante supressor tumoral. A holoenzima funcional da PP2A é heterotrimérica e composta por uma subunidade ancoradora, regulatória e catalítica (PP2Ac). A sequência conservada do extremo C-terminal (306DYFL309) da PP2Ac sofre modificações pós-traducionais que regulam a interação com outras subunidades e conferem seletividade ao substrato. A TIPRL é uma proteína conservada que interage e inibe a atividade da PP2Ac. Existe uma escassez nas informações sobre os mecanismo regulatórios e estruturais no processo de biogênese da PP2A e também do papel da TIPRL. Estudos utilizando co-imunoprecipitação combinada com western blot e MS foram propostos para analisar o processo de biogênese da PP2A comparando duas isoformas da PP2Ac: ativa e inativa. Informações estruturais da regulação da PP2A por TIPRL foram obtidos usando XL-MS e HDX-MS para estudar a estrutura e dinâmica da TIPRL em solução e complementar dados de cristalografia. Os resultados da biogênese da PP2A evidenciaram que esse processo ocorre em um tempo menor que 48 horas. O cristal da TIPRL humana é um novo fold, composto por folhas betas e uma fenda ligada a um peptídeo derivado do sítio de clivagem da enzima TEV. O peptídeo co-cristalizado (LYFQ) apresenta similaridade de sequência com o extremo C-terminal da PP2Ac. Análises de HDX-MS utilizando TIPRL e os tetrapeptídeos sintéticos (DYFL e DpYFL) demonstram que o extremo C-terminal da PP2Ac interage nessa fenda e existe maior afinidade com o peptídeo não fosforilado. Essas descobertas abrem novas vias de desenvolvimento de fármacos, já que a fenda na TIPRL pode ser alvo de fármacos para liberar a atividade da fosfatase em células cancerígenasAbstract: Chemical cross-linking followed by mass spectrometry (XL-MS) involves the covalent linkage of amino acids that are close in space by using chemical agents (cross-linkers). The cross-linkers act as molecular rules that provide information on distances between the cross-linked amino acids residues in the tertiary and quaternary structure of proteins. The hydrogen-deuterium exchange is a chemical reaction in which label hydrogen of proteins is replaced by a deuterium in solution. This technique coupled to mass spectrometry (HDX-MS) is used to study the conformation and dynamics of proteins and complexes. Hsp90 is a molecular chaperone that is crucial to maintain cellular homeostasis. Hsp90 also facilitates the transport of preproteins from the cytosol to the mitochondria via TOM complex, through interaction between cytosolic domain of Tom70 (Tom70C) and C-terminal domain of Hsp90 (CHsp90). Structural insights of CHsp90-Tom70C complex were investigated using XL-MS and HDX-MS. This strategy has identified a novel region of contact between CHsp90-Tom70C (TLRQKAEADKNDKSVKDLVILLY and helix A7, respectively). The new interface was confirmed via mitochondrial import assays. The results allowed to generate a low resolution molecular model to the CHsp90-Tom70C complex and fulfill information of the mechanism which preproteins are translocated via Tom70 to the mitochondria. Protein phosphatase 2A (PP2A) is a serine/threonine phosphatase in cells, which acts in several cellular processes and is an important tumor suppressor. Functional PP2A holoenzymes are heterotrimers composed of scaffold, regulatory and catalytic (PP2Ac) subunits. The catalytic subunit has a conserved C-terminus (306DYFL309) that undergoes post-translational modifications, which regulate the interactions with the other subunits and confer substrate selectivity. TIPRL is a conserved protein that binds and inhibits PP2Ac. There is a dearth of information regarding the regulatory and structural mechanisms in the assembly of PP2A heterotrimers and the possible role of TIPRL. Co-immunoprecipitation combined to western blot and MS were used to study the biogenesis process of PP2A using two PP2Ac isoforms: active and inative. The structural basis of regulation of PP2A by TIPRL was obtained using XL-MS and HDX-MS to understand the dynamics of TIPRL in solution and complement crystallographic data. The PP2A biogenesis analysis indicate that this process takes up to 48h. The crystal structure of human TIPRL is a new fold with beta-sheet core and a cleft bound to a peptide derived from TEV mediated cleavage of the affinity tag. The TEV-derived peptide (LYFQ) which co-crystallized had a striking similarity with the conserved C-terminus of PP2Ac. The HDX-MS analysis with TIPRL and synthetic tetrapeptides (DYFL and DpYFL) showed that this binding site in TIPRL structure actually harbors the C-terminus of PP2Ac and that TIPRL has a clear preference for the non-phosphorylated peptide. These findings open new drug development avenues as the presence of a druggable pocket in TIPRL could be targeted to release phosphatase activity in cancer cellsDoutoradoQuimica OrganicaDoutora em Ciências203800/2017-6CAPESCNP

Simplifying the human serum proteome for discriminating patients with bipolar disorder of other psychiatry conditions

FAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICOCAPES - COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIORAn exploratory analysis using proteomic strategies in blood serum of patients with bipolar disorder (BD), and with other psychiatric conditions such as Schizophrenia (SCZ), can provide a better understanding of this disorder, as well as their discriminati501811181125FAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICOCAPES - COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIORFAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICOCAPES - COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR2016/07384-7401170/2016-088887.115406/2015The authors thank the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brazil, 2016/07384-7), the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, Brazil, 401170/2016-0) and the Coordenação de Aperfei