Impact of the Histidine‐Containing Phosphocarrier Protein HPr on Carbon Metabolism and Virulence in Staphylococcus aureus

Carbon catabolite repression (CCR) is a common mechanism pathogenic bacteria use to link central metabolism with virulence factor synthesis. In gram‐positive bacteria, catabolite control protein A (CcpA) and the histidine‐containing phosphocarrier protein HPr (encoded by ptsH) are the predominant mediators of CCR. In addition to modulating CcpA activity, HPr is essential for glucose import via the phosphotransferase system. While the regulatory functions of CcpA in Staphylococcus aureus are largely known, little is known about the function of HPr in CCR and infectivity. To address this knowledge gap, ptsH mutants were created in S. aureus that either lack the open reading frame or harbor a ptsH variant carrying a thymidine to guanosine mutation at position 136, and the effects of these mutations on growth and metabolism were assessed. Inactivation of ptsH altered bacterial physiology and decreased the ability of S. aureus to form a biofilm and cause infections in mice. These data demonstrate that HPr affects central metabolism and virulence in S. aureus independent of its influence on CcpA regulation

Die Bedeutung des Histidin-haltigen Phosphatträger-Proteins für die Virulenz und die Pathogenität von Staphylococcus aureus

Einleitung und Fragestellung: Das durch das Gen ptsH codierte Histidin-haltige Phosphatträgerprotein (HPr) besitzt in verschiedenen Gram-positiven Bakterienarten sowohl eine Funktion im Phosphotransferasesystem (PTS) zur Glukoseaufnahme als auch eine Rolle als Cofaktor des Kataboliten-Kontrollproteins A (CcpA) in der Kohlenstoffkatabolitenrepression (CCR). Durch die Kohlenstoffkatabolitenrepression sind diese Mikroorganismen dazu in der Lage, in Anwesenheit bevorzugter Kohlenstoffquellen die Expression von Proteinen, die für die Aufnahme und Verstoffwechselung weniger bevorzugter Kohlenstoffquellen benötigt werden, zu reprimieren. Während die Funktionen des Kataboliten-Kontrollproteins A in Staphylococcus aureus gut charakterisiert sind, sollte im Rahmen dieser Arbeit anhand von ptsH- und ccpA-Deletionsmutanten die Rolle des Histidin-haltigen Phosphatträgerproteins im Hinblick auf die Involvierung im Phosphotransferasesystem als auch in der Kohlenstoffkatabolitenrepression untersucht werden. Dazu sollten der Staphylococcus aureus Wildtyp Newman und die isogenen Stämme einer ptsH Einzelmutante, einer ccpA Mutante, einer ptsH_ccpA Doppelmutante, einer ptsH* Mutante sowie einer ptsH Komplementante vergleichend untersucht werden. Die Newman ptsH* Mutante wurde durch eine Punktmutation in der Nukleotidsequenz von ptsH genetisch so verändert, dass im Translationsprodukt das Serin 46 durch ein Alanin ersetzt wird. Dadurch sollte das bifunktionelle Histidin-haltige Phosphatträgerprotein im Phosphotransferasesystem weiterhin aktiv, aber in der Kohlenstoffkatabolitenrepression funktionell gestört sein, um somit die jeweiligen Wirkungen des Histidin-haltigen Phosphatträgerproteins in den beiden zuvor genannten Prozessen unabhängig voneinander untersuchen zu können. Weiterhin sollte erforscht werden, ob das Histidin-haltige Phosphatträgerprotein auch unabhängig von dem Kataboliten-Kontrollprotein A eine Funktion in der Kohlenstoffkatabolitenrepression besitzt. Methoden: Zur Charakterisierung des Wachstumsverhaltens wurden vergleichende Messungen der optischen Dichte der Bakteriensuspensionen bei 600 nm im zeitlichen Verlauf und der pH-Werte des Kulturüberstands vorgenommen. Weiterhin sollte durch die Bestimmung der extrazellulären Metaboliten Glukose, Acetat und Ammonium der Einfluss der zuvor genannten Mutationen auf den Kohlenstoffmetabolismus sowie den Zucker-Import in S. aureus untersucht werden. Durch eine quantitative Echtzeit Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) wurden metabolische (citB, pckA) als auch Virulenzgene (RNAIII, hla, spa) in unterschiedlichen Wachstumsphasen des Bakteriums analysiert. Zum Schluss wurden die unterschiedlichen Mutanten in vivo in einem murinen Abszessmodell hinsichtlich ihres Infektionsverlaufes untersucht. Ergebnisse und Diskussion: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass unter glukosehaltigen Wachstumsbedingungen die beiden S. aureus Newman ptsH Mutanten (Einzelmutante und Doppelmutante), verglichen mit den übrigen zuvor genannten Newman Derivaten, eine Wachstumsverzögerung aufwiesen. Des Weiteren konnte ein beeinträchtigter Glukose-Import in den ptsH Mutanten festgestellt werden, der wahrscheinlich durch den Ausfall des Phosphotransferasesystem bedingt ist. Ferner zeigten sich neben der gestörten Glukoseaufnahme eine geringere Acetat-Akkumulation und konstant erhöhte pH-Werte im Kulturüberstand. Eine noch bei Anwesenheit von Glukose bereits beginnende Acetat-Wiederaufnahme lässt auf eine erhöhte Aktivität des Citratzyklus bei den ptsH Mutanten schließen. Diese Vermutung konnte durch bereits in der frühen exponentiellen Wachstumsphase erhöhte Transkriptkonzentrationen des citB Gens (codierend für das Citratzyklus-Enzym Aconitase) in den ptsH Mutanten durch quantitative Echtzeit Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion Analysen bestätigt werden. Auch für das in der Gluconeogenese involvierte Gen pckA wurden erhöhte Werte im Vergleich zum Wildtyp gemessen. In den beiden ptsH Deletionsmutanten konnten, verglichen mit dem Wildtyp, zudem bereits während der frühen Wachstumsphase eine Zunahme der Ammonium Konzentrationen beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass in der exponentiellen Wachstumsphase ein stärkerer Abbau von Aminosäuren als alternative Kohlenstoffquelle stattgefunden hat, da die Glukoseaufnahme und -verwertung durch das fehlende Histidin-haltige Phosphatträgerprotein gestört war. In einem murinen Abszessmodell, bei dem die Bakterien in das Gefäßsystem der Mäuse injiziert wurden, bewirkte die Deletion von ptsH im Stamm Newman 4 Tage nach der Infektion eine verminderte Bakterienlast in den untersuchten Organen Leber und Niere. Die abgeschwächten Infektionsverläufe in den mit den Newman ptsH Mutanten infizierten Tieren könnten durch einen veränderten Metabolismus erklärt werden, da diese Mutanten vermutlich auch unter in vivo Bedingungen in der Glukoseaufnahme eingeschränkt sind. Des Weiteren könnte die reduzierte Bakterienlast in den mit den ptsH Mutanten infizierten Tieren auf eine fehlende Interaktion zwischen dem Histidin-haltigen Phosphatträgerprotein und dem Kataboliten-Kontrollprotein A zurückzuführen sein. In vorherigen Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass das Kataboliten-Kontrollprotein A die Transkription des für die Virulenz von S. aureus bedeutsamen Virulenzfaktors hla, welcher für das α-Hämolysin codiert, beeinflusst. Im Rahmen dieser Arbeit konnte in den durchgeführten quantitative Echtzeit Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion Analysen bereits in den frühen Wachstumsphasen erhöhte hla Transkriptionsraten in den ccpA als auch ptsH Mutanten beobachtet werden, sodass nicht ausgeschlossen werden kann, dass das Histidin-haltige Phosphatträgerprotein die Expression von hla auch unter in vivo Bedingungen beeinflusst. Zusammenfassend hat das Histidin-haltige Phosphatträgerprotein eine wichtige Rolle als metabolischer Regulator, der großen Einfluss auf die Virulenz von S. aureus nimmt.Background and question: The histidine-containing phosphocarrier protein (HPr), encoded by the ptsH gene, is thought to exhibit a dual function in gram positive bacteria, as a phosphate donor for the incoming sugar in the phosphotransferase system (PTS), and as a cofactor of the catabolite control protein A (CcpA), a master regulator of carbon catabolite repression (CCR). CCR allows microorganism to favor the import and metabolization of preferred carbon sources and to repress the expression of various genes, which are responsible for the uptake and break down of less favored carbon sources. In this dissertation, the role of HPr in Staphylococcus aureus strain Newman was studied with regard to its involvement in the PTS and in CCR on the basis of ptsH- and ccpA-deletion mutants. For this purpose, the S. aureus wildtype Newman and the isogenic strains of a ptsH mutant, a ccpA mutant, a ptsH ccpA double mutant, a ptsH* mutant and a ptsH mutant complemented with the wild-type allele should be compared. The ptsH* mutant was genetically modified by introducing a point mutation in the nucleotide sequence of ptsH, which in turn results in a serine to alanine substitution at amino acid 46 of HPr. Thereby, a HPr variant is expected that is still functional in the PTS but is unable to bind to and activate CcpA, which should allow investigating independently the respective effects of HPr in both previously mentioned processes. Additionally, a CcpA-independent role of HPr in CCR should be investigated. Methods: For this purpose, S. aureus Newman and mutant cells were batch cultured and optical densities at 600 nm and pH values were determined over time in order to characterize the growth behavior of the individual derivatives. By determining the contents of glucose, acetate and ammonia in culture supernatants over time, the carbohydrate metabolism and sugar import capacities of the S. aureus Newman strain set were investigated. To get an idea about the impact of HPr on the transcriptome of S. aureus, transcription rates of selected metabolic genes (i.e. citB, pckA), and genes encoding regulatory and virulence factors (i.e. RNAIII, hla, and spa) were determined by quantitative realtime Reverse-Transcriptase PCR (qRT-PCR) at different bacterial growth stages. Finally, the importance of HPr for infectivity of S. aureus was studied under in vivo conditions in a murine S. aureus abscess model. Results and conclusion: I found that the ptsH mutants (single mutant and double mutant) exhibited a growth delay compared to the other strains under glucose-containing growth conditions. Furthermore, a marked reduction in glucose import was noticed for both mutants, which is probably due to an impairment of the PTS. In addition to the reduced sugar uptake kinetics, significantly lower extracellular acetate accumulation rates and constantly higher pH values were observable in the culture supernatants of both ptsH mutants. Both ptsH mutants also already started to reutilize the exported acetate when glucose was still present in the growth media, which suggests an earlier onset of the tricarboxylic acid cycle in the ptsH mutants when compared to the wild type. This assumption was confirmed by qRT-PCR analyses, which identified increased transcription rates for the tricarboxylic acid cycle enzyme aconitase encoding gene citB as well as for pckA, a gene encoding for PckA, a keyenzyme in gluconeogenesis, in both ptsH mutants during early growth stages. Compared to the wild type, both ptsH mutants already showed an increase in ammonia concentration during the early growth phases. This indicates that an increased breakdown of amino acids - as an alternative carbon source - took place during exponential growth phase, since the glucose uptake and utilization was disturbed by the impaired HPr. In a murine abscess model in which the bacteria were injected into the vascular system of the mice, the deletion of ptsH resulted in a significantly reduced bacterial load in the investigated organs liver and kidney at 4 days post infection. The attenuated infectivity of the ptsH mutants might be explained on the one hand by an altered metabolism, since both mutants are likely to display reduced glucose uptake rates under in vivo conditions. Another explanation for the reduced bacterial loads in ptsH mutant-infected mice might go beyond this specific role in sugar import and involve the interplay between HPr and CcpA. Earlier work demonstrated that CcpA affects the transcription of hla, encoding -hemolysin, which is a major virulence factor of S. aureus. -hemolysin is involved during abscess formation. During the course of this study, elevated hla transcription rates in ccpA and ptsH mutants were already observed during the early growth stage. This suggests that HPr might impact the expresion of hla, even under in vivo conditions. The findings presented in this thesis demonstrate that HPr of S. aureus has important roles in carbon utilization and metabolization, and also affects infectivity of this important human pathogen

Impact of the Histidine-Containing Phosphocarrier Protein HPr on Carbon Metabolism and Virulence in Staphylococcus aureus

Carbon catabolite repression (CCR) is a common mechanism pathogenic bacteria use to link central metabolism with virulence factor synthesis. In gram-positive bacteria, catabolite control protein A (CcpA) and the histidine-containing phosphocarrier protein HPr (encoded by ptsH) are the predominant mediators of CCR. In addition to modulating CcpA activity, HPr is essential for glucose import via the phosphotransferase system. While the regulatory functions of CcpA in Staphylococcus aureus are largely known, little is known about the function of HPr in CCR and infectivity. To address this knowledge gap, ptsH mutants were created in S. aureus that either lack the open reading frame or harbor a ptsH variant carrying a thymidine to guanosine mutation at position 136, and the effects of these mutations on growth and metabolism were assessed. Inactivation of ptsH altered bacterial physiology and decreased the ability of S. aureus to form a biofilm and cause infections in mice. These data demonstrate that HPr affects central metabolism and virulence in S. aureus independent of its influence on CcpA regulation