Performance and Diagnostic Value of Genome-Wide Noninvasive Prenatal Testing in Multiple Gestations.

OBJECTIVE: To evaluate the accuracy and diagnostic value of genome-wide noninvasive prenatal testing (NIPT) for the detection of fetal aneuploidies in multiple gestations, with a focus on dichorionic-diamniotic twin pregnancies. METHODS: We performed a retrospective cohort study including data from pregnant women with a twin or higher-order gestation who underwent genome-wide NIPT at one of the eight Belgian genetic centers between November 1, 2013, and March 1, 2020. Chorionicity and amnionicity were determined by ultrasonography. Follow-up invasive testing was carried out in the event of positive NIPT results. Sensitivity and specificity were calculated for the detection of trisomy 21, 18, and 13 in the dichorionic-diamniotic twin cohort. RESULTS: Unique NIPT analyses were performed for 4,150 pregnant women with a multiple gestation and an additional 767 with vanishing gestations. The failure rate in multiple gestations excluding vanishing gestations ranged from 0% to 11.7% among the different genetic centers. Overall, the failure rate was 4.8%, which could be reduced to 1.2% after single resampling. There were no common fetal trisomies detected among the 86 monochorionic-monoamniotic and 25 triplet cases. Two monochorionic-diamniotic twins had an NIPT result indicative of a trisomy 21, which was confirmed in both fetuses. Among 2,716 dichorionic-diamniotic twin gestations, a sensitivity of 100% (95% CI 74.12-100%) and a specificity of 100% (95% CI 99.86-100%) was reached for trisomy 21 (n=12). For trisomy 18 (n=3), the respective values were 75% (95% CI 30.06-95.44%) sensitivity and 100% (95% CI 99.86-100%) specificity, and for trisomy 13 (n=2), 100% (95% CI 20.65-100%) sensitivity and 99.96% (95% CI 99.79-99.99%) specificity. In the vanishing gestation group, 28 NIPT results were positive for trisomy 21, 18, or 13, with only five confirmed trisomies. CONCLUSION: Genome-wide NIPT performed accurately for detection of aneuploidy in dichorionic-diamniotic twin gestations

Le Diagnostic Prénatal Non Invasif sur cellules fœtales :Mythe ou réalité ?

Ce projet comportait deux grandes étapes clés :1/ L’identification et l’isolation de cellules fœtales à partir d’un frottis de col utérin chez la femme enceinte. 2/ La réalisation d’analyses moléculaires et cytogénétiques à partir de quelques cellules. Nous avons principalement cherché à développer l’analyse génétique par la technique de CGH-array. Pour cette seconde partie, le nombre théorique de cellules fœtales pouvant être isolées à partir d’un frottis de col utérin était nettement insuffisant pour fournir la quantité d’ADN nécessaire à la réalisation de la technique. En effet, le nombre de cellules trophoblastiques isolées à partir d’un frottis exocervical a été décrit comme compris entre 10 et 60 cellules (Pfeifer et al. 2016). Sachant qu’une cellule représente en moyenne 6pg d’ADN et que nous devions engager au minimum 100µg pour pouvoir réaliser la technique de CGH-array, il était évident que nous n’aurions pas assez de matériel génétique fœtal. Une étape intermédiaire d’amplification du génome complet ou de « Whole Genome amplification » (WGA) s’avérait donc nécessaire et devait être mise au point afin de pouvoir obtenir un ADN de qualité en quantité suffisante pour la réalisation de la technique de CGH-array (aCGH) sur quelques cellules. Cette étape d’amplification du génome complet (WGA) a, parallèlement, servi à mettre au point le dépistage préimplantatoire (DPI) au stade « blastocyste » (jour 5 du développement embryonnaire) et à l’implémenter en routine en « Procréation Médicalement Assistée » (Service de la Fertilité de l’Hôpital Erasme). L’intérêt de son développement durant ce travail de thèse était donc leur objectif commun :réaliser une analyse génétique par CGH-array sur seulement quelques cellules. Pour le projet initial, le but était de faire du diagnostic par CGH-array sur quelques potentielles cellules fœtales isolées d’un frottis de col maternel. Au cours de la mise au point du DPI J5, le but était de faire du diagnostic d’anomalies chromosomiques par CGH-array sur une à quelques cellules biopsiées d’un embryon (DPI SR ± A). Dernièrement, une méta-analyse des diagnostics prénataux invasifs par CGH-array, effectués entre 2016 à 2019 au sein du Centre de Génétique Humaine – ULB, a été réalisée comme troisième point de ce travail de thèse. Les objectifs étaient d’avoir une réelle vue d’ensemble sur les différentes techniques de diagnostic prénatal, de comparer les données actuelles à celles publiées antérieurement en Belgique et de nous positionner par rapport à une littérature plus globale.Le Chapitre B. traite la première étape du projet et consiste en la mise au point d’une méthode de collection, de détection et d’isolation de cellules d’origine fœtale à partir d’un frottis de col utérin chez la femme enceinte dès 5 semaines de grossesse. Le but principal était de développer une technique fiable, reproductive, précoce et non invasive de diagnostic prénatal non invasif sur cellules trophoblastiques retrouvées dans le col utérin maternel. Après avoir réalisé la revue de la littérature du diagnostic prénatal non invasif sur cellules d’origine fœtale retrouvées dans le tractus génital de la femme enceinte, nous avons choisi de mettre au point une technique innovante associant la méthode de prélèvement cervical la moins invasive à une méthode d’isolation cellulaire objective (non basée sur isolation par reconnaissance morphologique) offrant une grande pureté cellulaire et réalisable aisément à grande échelle en routine. Dès lors, nous avons choisi d’utiliser un frottis de col utérin « exocervical » utilisant une cytobrosse particulière (broom-like) puisqu’il s’agit de la technique de prélèvement cervical décrite comme la moins invasive (Pfeifer et al. 2016) et utilisée en routine lors des consultations gynécologiques comme test de dépistage du cancer du col de l’utérus, y compris chez la femme enceinte quand cela s’avère nécessaire. Comme méthode de purification cellulaire, nous avons choisi de tester des techniques d’immunoisolation au moyen d’anticorps ciblant l’antigène trophoblastique HLA-G. Préalablement à l’application sur frottis exocervicaux, nous avons validé notre technique sur des lignées cellulaires « contrôles ». Les conditions optimales de traitement de l’échantillon et de son immunomarquage avec des anticorps anti-HLA-G ont donc d’abord été établies par immunohistochimie sur des lignées cellulaires HLA-G positive et HLA-G négatives. Elles ont ensuite été appliquées aux frottis de col de femmes enceintes et non enceintes en IHC, puis adaptées pour l’immunoisolation cellulaire par « Flow Activated Cells Sorting » (FACS) et « Magnetic Activated Cells Sorting » (MACS). Enfin, nous avons appliqué, sur frottis exocervicaux, la « digital droplet Polymerase Reaction Chain » (ddPCR), une technique sensible et quantitative des évènement rares dans le but d’estimer le nombre de cellules fœtales potentiellement retrouvées dans ce type de prélèvement.En collaboration avec le Laboratoire de la Fertilité, nous avons mis au point la technique de biopsie de l’embryon au jour cinq, lorsqu’il forme le blastocyste, afin de pouvoir prélever en moyenne 5 cellules (2-10 cellules) du trophectoderme (futur placenta) sans toucher à la masse cellulaire interne (futur embryon). Cette technique offre la possibilité de détecter une anomalie génétique ciblée (DPI moléculaire) et nous a également permis de mettre au point la technique de diagnostic prénatal non invasif par CGH-array sur cellules embryonnaires. Réaliser la technique de CGH-array sur quelques cellules était donc le défi de cette partie du travail puisque la détection reproductible des CNVs (Copy Number Variation) par cette technique nécessite en moyenne 200ng d’ADN. Bien qu’il soit possible de la faire sur une quantité minimale de 100ng, cela reste nettement supérieur à ce que l’on peut obtenir par biopsie de 1 à 10 cellules embryonnaires sachant qu’une cellule comporte environ 6pg d’ADN dans son noyau. Pour surpasser cette limite quantitative, une étape intermédiaire d’amplification du génome complet (Whole Genome Amplification ou WGA) s’avérait nécessaire. Le DPI au jour 5 est ainsi utilisé en routine depuis 2019 et un bilan des embryons testés sur un an a été réalisé. Toute cette partie du travail est détaillée dans le Chapitre C.Le Chapitre D. reprend la méta-analyse des diagnostics prénataux par CGH-array, réalisés sur procédures invasives. Les objectifs de ce travail étaient d’obtenir une vue générale de différentes fréquences en termes d’indications d’un diagnostic prénatal, de diagnostics d’anomalies génétiques et de déterminer si une information clé en ressortait. Cette étude nous a permis d’obtenir des informations essentielles sur l’apport de l’analyse prénatale par CGH-array telles que l’indication de diagnostic prénatal invasif la plus fréquente, le nombre de diagnostics effectués en présence d’un signal d’appel fœtal, c’est-à-dire le nombre de CNVs (Copy Number Variation) pathogéniques diagnostiqués en présence d’un signe d’appel fœtal (population pathogénique) ou encore la fréquence de découvertes fortuites dans une population où la procédure invasive n’est pas réalisée pour effectuer une CGH-array en première intention, c’est-à-dire lorsqu’un CNVs pathogénique était diagnostiqué par la technique sans présence d’anomalie fœtale. De même, cette étude a permis d’aborder la problématique des VOUS en évaluant si de nouveaux liens entre le génotype et le phénotype pouvaient être établis afin d’éventuellement reclasser le CNV en tant que variant bénin ou pathologique. Elle a enfin permis de rechercher une éventuelle récurrence de certains CNVs non bénins ainsi que de revoir les locus de susceptibilité et leur potentiel impact sur l’évolution de l’enfant.Doctorat en Sciences médicales (Médecine)info:eu-repo/semantics/nonPublishe

Rarity of fetal cells in exocervical samples for noninvasive prenatal diagnosis.

The possibility to isolate fetal cells from pregnant women cervical samples has been discussed for five decades but is not currently applied in clinical practice. This study aimed at offering prenatal genetic diagnosis from fetal cells obtained through noninvasive exocervical sampling and immuno-sorted based on expression of HLA-G.info:eu-repo/semantics/publishe

Prenatally detected copy number variants in a national cohort: A postnatal follow-up study

Objective Belgian genetic centers established a database containing data on all chromosomal microarrays performed in a prenatal context. A study was initiated to evaluate postnatal development in children diagnosed prenatally with a non-benign copy number variant (CNV). Methods All children diagnosed with a prenatally detected non-benign CNV in a Belgian genetic center between May 2013 and February 2015 were included in the patient population. The control population consisted of children who had undergone an invasive procedure during pregnancy, with no or only benign CNVs. Child development was evaluated at 36 months using three (3) questionnaires: Ages and Stages Questionnaire Third edition, Ages and Stages Questionnaire Social-Emotional Second Edition and a general questionnaire. Results A significant difference in communication and personal-social development was detected between children with a reported susceptibility CNV and both children with an unreported susceptibility CNV and the control population. The outcome of children with a particular CNV is discussed in a case-by-case manner. Conclusion Our postnatal follow-up project of children with a prenatally detected non-benign CNV is the first nationwide project of its kind. A higher number of cases for each CNV category is however needed to confirm our findings

Prenatally detected copy number variants in a national cohort : a postnatal follow-up study

Objective Belgian genetic centers established a database containing data on all chromosomal microarrays performed in a prenatal context. A study was initiated to evaluate postnatal development in children diagnosed prenatally with a non-benign copy number variant (CNV). Methods All children diagnosed with a prenatally detected non-benign CNV in a Belgian genetic center between May 2013 and February 2015 were included in the patient population. The control population consisted of children who had undergone an invasive procedure during pregnancy, with no or only benign CNVs. Child development was evaluated at 36 months using three (3) questionnaires: Ages and Stages Questionnaire Third edition, Ages and Stages Questionnaire Social-Emotional Second Edition and a general questionnaire. Results A significant difference in communication and personal-social development was detected between children with a reported susceptibility CNV and both children with an unreported susceptibility CNV and the control population. The outcome of children with a particular CNV is discussed in a case-by-case manner. Conclusion Our postnatal follow-up project of children with a prenatally detected non-benign CNV is the first nationwide project of its kind. A higher number of cases for each CNV category is however needed to confirm our findings

Prenatally detected copy number variants in a national cohort: A postnatal follow-up study

OBJECTIVE: Belgian genetic centers established a database containing data on all chromosomal microarrays performed in a prenatal context. A study was initiated to evaluate postnatal development in children diagnosed prenatally with a non-benign copy number variant (CNV). METHODS: All children diagnosed with a prenatally detected non-benign CNV in a Belgian genetic center between May 2013 and February 2015 were included in the patient population. The control population consisted of children who had undergone an invasive procedure during pregnancy, with no or only benign CNVs. Child development was evaluated at 36 months using three (3) questionnaires: Ages and Stages Questionnaire Third edition, Ages and Stages Questionnaire Social-Emotional Second Edition and a general questionnaire. RESULTS: A significant difference in communication and personal-social development was detected between children with a reported susceptibility CNV and both children with an unreported susceptibility CNV and the control population. The outcome of children with a particular CNV is discussed in a case-by-case manner. CONCLUSION: Our postnatal follow-up project of children with a prenatally detected non-benign CNV is the first nationwide project of its kind. A higher number of cases for each CNV category is however needed to confirm our findings.status: publishe

Outcome of publicly funded nationwide first-tier noninvasive prenatal screening

Purpose Noninvasive prenatal screening (NIPS) using cell-free DNA has transformed prenatal care. Belgium was the first country to implement and fully reimburse NIPS as a first-tier screening test offered to all pregnant women. A consortium consisting of all Belgian genetic centers report the outcome of two years genome-wide NIPS implementation. Methods The performance for the common trisomies and for secondary findings was evaluated based on 153,575 genome-wide NIP tests. Furthermore, the evolution of the number of invasive tests and the incidence of Down syndrome live births was registered. Results Trisomies 21, 18, and 13 were detected in respectively 0.32%, 0.07%, and 0.06% of cases, with overall positive predictive values (PPVs) of 92.4%, 84.6%, and 43.9%. Rare autosomal trisomies and fetal segmental imbalances were detected in respectively 0.23% and 0.07% of cases with PPVs of 4.1% and 47%. The number of invasive obstetric procedures decreased by 52%. The number of trisomy 21 live births dropped to 0.04%. Conclusion Expanding the scope of NIPS beyond trisomy 21 fetal screening allows the implementation of personalized genomic medicine for the obstetric population. This genome-wide NIPS approach has been embedded successfully in prenatal genetic care in Belgium and might serve as a framework for other countries offering NIPS