Etude dynamique et structurale de biomolécules par microscopie à force atomique HS-AFM (application à une petite protéine de choc thermique sHsp)

La microscopie à force atomique (AFM) permet de visualiser la topographie d échantillons organiqueset inorganiques à l échelle atomique. Les innovations les plus récentes offrent désormais la possibilitéd accéder aux propriétés nano-mécaniques des échantillons (élasticité, adhésion ). Son panel defonctionnalités permet de pallier aux besoins des nanotechnologies, tant dans les domaines de laphysique, de la chimie que de la biologie.Cependant, les besoins nécessaires à la compréhension des processus biologiques imposent aumicroscope à force atomique des vitesses d acquisitions rapides, inférieures à la seconde par image. Leséquipements classiques n offrent pas cette possibilité. C est pour s affranchir de ce verrou technologique,pour l étude dynamique, qu un prototype de microscope à force atomique à haute-vitesse a étédéveloppé (HS-AFM) en partenariat avec l équipe du Professeur T. Ando à l Université de Kanazawa(Japon). Il permet d atteindre des vitesses de balayage identiques aux vitesses vidéos : 25-50 images/s, enmilieu liquide. Le dispositif est en perpétuelle amélioration : nouvelle boucle d asservissement, domainesde balayage augmentés. La haute résolution est, quant à elle, assurée par des leviers miniaturisés munisde sur-pointes en carbone. Parallèlement à l innovation du microscope en lui-même, des modulescomplémentaires ont été développés : module pousse seringue et module chauffant.Le potentiel de ce prototype, développé dans le cadre d un programme ANR PNANO 2008 HSnanobio-Imaging, a été montré via l étude d une petite protéine de choc thermique : la protéine sHspLo18. Cette protéine, issue de la bactérie lactique Oenococcus oeni, offrait la possibilité d étudier deschangements de degrés d oligomérisation en fonction du pH, ainsi que le rôle chaperon et lipochaperonen cas de stress environnemental d autres complexes biologiques. L utilisation des techniques demicroscopie couplée à des études biochimiques sur ce modèle protéique a permis d appréhender l effetdes surfaces sur l adsorption et la dynamique des complexes biologiques. L interaction protéine surfacea pu être approchée et s avère utile au développement des capteurs à protéinesThe atomic force microscopy (AFM) gives access to the topography of organic and inorganic samplesat the atomic scale. The latest innovations offer the possiblity to understand the sample nano-mechanicalproperties (elasticity, adhesion...). Its feature set allows overcoming the demands of nanotechnology,both in the fields of physics, chemistry and biology.However, understanding biological processes require faster acquisitions for the atomic forcemicroscopy, less than a second per frame. As conventional equipment does not offer the possibility toovercome the constraint of time for dynamical studies, a prototype of high-speed atomic forcemicroscope (HS-AFM) was developed in partnership with Professor T. Ando group of Kanazawa University(Japan). It can reach scanning video speed: 25-50 frames/s in a liquid medium. The device is beingconstantly improved: new feedback control, larger scanning sizes. The resolution is provided byminiaturized cantilevers with carbon EBD-tips. In parallel to innovative modules on the microscope, addonshave been developed: syringe pump and heating modules.The potential of the prototype, developed within the framework of the program ANR PNANO 2008HS-nanobio-Imaging, has been shown through the study of a small heat shock protein: the protein sHspLo18. This protein, from the lactic acid bacterium Oenococcus oeni, offered the possibility of a variouschanges of oligomerization degrees according to the pH, and also the chaperone and lipochaperon activityof protein under the influence of an environmental stress. The use of these techniques of microscopiescoupled with biochemical studies on this proteic model allowed to dread the effect of surfaces on theadsorption and the dynamics of biological complexes. The interaction protein surface coulb be toapprehend and proves to be useful for the development of protein sensors developed in the laboratoryDIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

Interpretation of the sonic hedgehog morphogen gradient by a temporal adaptation mechanism

Morphogens act in developing tissues to control the spatial arrangement of cellular differentiation(1,2). The activity of a morphogen has generally been viewed as a concentration-dependent response to a diffusible signal, but the duration of morphogen signalling can also affect cellular responses(3). One such example is the morphogen sonic hedgehog (SHH). In the vertebrate central nervous system and limbs, the pattern of cellular differentiation is controlled by both the amount and the time of SHH exposure(4-7). How these two parameters are interpreted at a cellular level has been unclear. Here we provide evidence that changing the concentration or duration of SHH has an equivalent effect on intracellular signalling. Chick neural cells convert different concentrations of SHH into time-limited periods of signal transduction, such that signal duration is proportional to SHH concentration. This depends on the gradual desensitization of cells to ongoing SHH exposure, mediated by the SHH-dependent upregulation of patched 1 (PTC1), a ligand-binding inhibitor of SHH signalling(8). Thus, in addition to its role in shaping the SHH gradient(8-10), PTC1 participates cell autonomously in gradient sensing. Together, the data reveal a novel strategy for morphogen interpretation, in which the temporal adaptation of cells to a morphogen integrates the concentration and duration of a signal to control differential gene expression.Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/62511/1/nature06347.pd

Role for miR-204 in human pulmonary arterial hypertension

Reduced miR-204 expression facilitates the excessive proliferation and apoptosis resistance of pulmonary artery smooth muscle cells characteristic of human pulmonary arterial hypertension

High speed bio atomic force microscopy (application à l'étude de la structure et dynamique d'assemblage supramoléculaires)

Le microscope à force atomique (AFM) fait partie des microscopies de champ proche dites à sonde locale. De par sa versatilité, un grand nombre de domaines des nanosciences tant en physique, que chimie ou biologie utilisent cette technique. Cependant, le champ d investigation de la microscopie AFM classique est restreint temporellement et spatialement. En effet, en raison de sa limite de vitesse d acquisition d image et sa limite de caractérisation des interactions en surface, des études de dynamique moléculaire ou d éléments sub-surface ne sont pas envisageables. Nous montrons donc que la caractérisation en volume est permise en utilisant une méthode d imagerie non destructive, la microscopie de champ proche holographique ultrasonore (SNFUH). Cette méthode développée pour étudier à l.air et en liquide, a fourni des informations localisées en profondeur avec une haute résolution spatiale, en utilisant des fréquences de résonance dans la gamme du MHz. Une calibration a été effectuée sur des échantillons de structures enterrées ou non, réalisés par lithographie e-beam. Ces échantillons ont été utilisés pour ajuster les fréquences de résonance et comprendre la formation des images en mode acoustique (profondeur investiguée et inversion de contraste). Cet outil non invasif et innovant de caractérisation a donc été développé. Il présente un énorme potentiel pour des échantillons biologiques en termes de résolution et d information. Les microscopes AFMclassique et acoustique SNFUH sont soumis à des contraintes de temps. Pour s en affranchir, un prototype, le microscope à force atomique haute-vitesse (HS-AFM) a été développé par l équipe du Professeur T. Ando à l Université de Kanazawa (Japon). Il autorise ainsi le balayage à vitesse vidéo, i.e. 25 images/s, en milieu liquide. Nous avons amélioré le prototype avec une nouvelle génération de boucle d asservissement et augmenté la zone de caractérisation. La résolution dépend fortement du levier utilisé. De plus une qualité d image supérieure est obtenue grâce à l utilisation de surpointes en carbone sur ces mêmes leviers. Finalement, nous montrons des résultats obtenus avec ces deux techniques de microscopies sur différents édi.ces biologiques en milieu liquide. Ainsi, avec le microscope AFM haute-vitesse, des dynamiques biomoléculaires ont pu être visualisées (ex : structures protéine-ADN) avec une résolution nanométrique. Puis une étude des changements conformationnels intracellulaires de kératinocytes vivantes dans leur milieu physiologique a été réalisée par microscopie acoustique SNFUH et montre la dégradation du matériel biologique. L ensemble de ces résultats ouvre un nouveau champ d investigation dans le domaine de la biologie.The atomic force microscope (AFM) made part of scanning near-field probe microscopy. Thanks to its versatility, many fields as physics, chemistry or biology use this technique. However, the field of investigation of the classical AFM microscope is limited temporally and spatially. Indeed, due to his scan speed limitation and surface interaction caracterisation limitation, studies of molecular dynamics and sub-surface elements are not possible. We show that the volume caracterisation is permitted using a non-destructive imaging method, called Scanning Near-Field by Ultrasound Holography (SNFUH). This tool developed for study in air and liquid has provided depth information as well as spatial resolution at the nanometer scale using resonant frequencies of about range of MHz. Calibration has been performed on samples of buried or not structures made by e-beam lithography and have been used to adjust the resonant frequency and understand the acoustic image formation (depth investigation and contrast in-version). We have developed a non-invasive and innovative tool of characterization for biology : he presents a huge potential for biological samples in terms of resolution and information. Classical AFM and acoustic SNFUH microscopes are time resolution limited. To overcome this time constraint, a prototype, High Speed Atomic Force Microscope (HS-AFM), has been developed by the team of Prof. T. Ando, Kanazawa University (Japan). It allows a scan rate at video speed, i.e. 25 frames/s, in liquid medium. We have improved the prototype, through a new generation of feedback control and increased the scan area. The resolution depends strongly of the probe used. Moreover a better image quality is obtained through the use of carbon tips on these cantilevers. Finally, we show our results obtained with these two microscopy techniques about biological buildings in liquid environment. Thereby, with the HS-AFM microscope, biomolecular dynamics have been visualized (e.g. protein-DNA structures) with nanometric resolution. Then a study about intracellular conformational changes of keratinocytes living cells in their physiological medium has been realized by acoustic microscopy SNFUH and show deterioration of biological components. All of these results provide new insights in biology field.DIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

Couplages assistés par plasmons de surface

DIJON-BU Sciences Economie (212312102) / SudocSudocFranceF

De l'animal au parchemin : histoire, environnement, génétique

National audienceLe parchemin est une peau d’animal minutieusement préparée pour servir de support à l’écriture. Comment élabore-t-on un parchemin ? Qui sont les éleveurs de bétail, les parcheminiers au Moyen-Âge ? Vous le découvrirez grâce aux chartes, registres et partitions musicales exposés

Conception d'un microlevier et analyse de sa réactivité avec un gaz (application à la réalisation d'un capteur de détection de florure d'hydrogène)

L'objectif de ce travail était le développement d'un capteur de fluorure d'hydrogène (HF) par réponse mécanique de microleviers SiOx et Si3N4 de dimensions 200300,5 æm. Leur élaboration utilise des méthodes de dépôts de couches minces, de lithographie et de gravure ionique réactive. Une étude XPS, SIMS, AFM des couches sensibles montre une attaque latérale pour SiOx et transverse pour Si3N4. Une fine couche d'or (inerte au HF) est déposée sur l'une des faces du levier, le rendant sensible à la température et la tension de surface. La sensibilité du système à la température, la pression et le taux d'humidité a été déterminée. La réactivité du microlevier vis-à-vis de HF a été mesurée en terme de déflexion et de fréquence de résonance. La réponse du capteur dépend de la dose de HF introduite dans la cellule. Le gaz est ainsi détecté en terme de déflexion irréversible jusqu'à 260 ppb. L'influence de la rugosité de surface et de la stœchiométrie des couches réactives a été démontrée.The objective of this work was the development of an hydrogen fluoride (HF) sensor by mechanical response of SiOx and Si3N4 microcantilevers that have typical dimensions of 200300.5 æm. Their fabrication uses thin films coating, lithography and reactive ion etching processes. A XPS, SIMS, AFM study of the dielectric layers shows a lateral etching orientation for SiOx and a transversal one for Si3N4. A gold layer (not reactive) is deposited on one face of the cantilever, making it sensitive to both temperature and surface stress. The sensitivity of the system to the temperature, pressure and humidity has been defined. SiOx and Si3N4 layers reactivity toward HF was measured in term of deflection and frequency resonance variation. The response of the sensor depends on the amount of HF introduced into the cell. The gas is then detected in term of irreversible deflection until 260 ppb. The influence of the surface roughness and stoichiometry of the reactive layers was demonstrated.DIJON-BU Sciences Economie (212312102) / SudocSudocFranceF

Du parchemin à l’ADN : le dialogue entre les sciences historiques et les sciences du vivant

National audienc

Infrared nanospectroscopic mapping of DNA molecules on mica surface

Significant efforts have been done in last two decades to develop nanoscale spectroscopy techniques owning to their great potential for single-molecule structural detection and in addition, to resolve open questions in heterogeneous biological systems, such as protein-DNA complexes. Applying AFM-IR technique has become a powerful leverage for obtaining simultaneous absorption spectra with a nanoscale spatial resolution for studied proteins, however the IR-AFM investigation of DNA molecules on surface, as a benchmark for a nucleoprotein complexes nanocharacterization, has remained elusive. Herein, we demonstrate methodological approach for acquisition of IR-AFM mapping modalities with corresponding absorption spectra based on two different DNA deposition protocols on spermidine and Ni2+ pretreated mica surface. The nanoscale IR absorbance of distinctly formed DNA morphologies on mica are demonstrated through series of IR-AFM absorption maps with corresponding IR spectrum. Our results thus demonstrate the sensitivity of IR-AFM nanospectroscopy for a nucleic acid research with an open potential to be employed in further investigation of nucleoprotein complexes