Sensitizing triple negative breast cancer to approved therapies: Design, synthesis and biological activity of MNK inhibitors

La desregulació de la síntesi de proteïnes és comuna en càncer. Un factor clau en el control de la traducció de proteïnes és el factor d'inici de la traducció 4E (eIF4E) que es troba regulat per les cinases MNK1/2 (MAP kinase interacting kinases 1 i 2) mitjançant fosforilació. En els últims anys, l’eIF4E s'ha descrit com un factor de pronòstic independent associat amb la progressió maligna i el desenvolupament de resistència. A més, l’eIF4E es troba sobreexpressat en càncer d'ovari, mama, pulmó, bufeta i pròstata. La fosforilació de l'eIF4E és necessària per a la transformació tumoral però és prescindible per al desenvolupament normal. Per tant, la inhibició farmacològica de les MNKs pot proporcionar una estratègia no tòxica i eficaç per al tractament del càncer, especialment en combinació amb els tractaments aprovats. En aquest projecte, es proposen els sistemes pirazolo[3,4-b]piridínics com a possibles candidats a inhibidors de MNK degut a la seva similitud amb inhibidors coneguts. S'han estudiat les possibilitats sintètiques que ofereixen aquestes estructures, definint metodologies generals per introduir substitucions selectives i controlades en 6 punts diferents de la molècula. A més, s'han descrit els mecanismes de reacció. S'han estudiat 5 famílies de compostos basades en les pirazolo[3,4-b]piridines i una de les famílies ha mostrat una activitat interessant en els assajos preliminars. S'han identificat tres compostos (EB1-3), amb valors micromolars de IC50 (0.7-4 μM), que inhibeixen de forma completa i selectiva les MNKs (entre 2.5 i 5 μM) i sense presentar citotoxicitat en cèl·lules de càncer de mama triple negatiu (MDA-MB-231). A més, el co tractament amb EB1 augmenta la sensibilitat de les cèl·lules MDA-MB-231 a la doxorubicina, millorant la seva eficàcia d'inhibir el creixement cel·lular. S'ha fet servir una estratègia de disseny basada en estructura per estudiar el mecanisme d'interacció dels diferents candidats. S'han creat models de les formes actives i inactives de MNK1 que s'han fet servir per predir la manera d'unió dels candidats. EB1 s'ha definit com un inhibidor de tipus II que s'uneix selectivament la forma inactiva de MNK1 i interacciona amb el motiu DFD (Asp-Phe-Asp), característic de les MNKs.La desregulación de la síntesis de proteínas es común en cáncer. Un factor clave en el control de la traducción de proteínas es el factor de inicio de la traducción 4E (eIF4E) cuya función está modulada por las quinasas MNK1/2 (MAP kinase interacting kinases 1 y 2) mediante fosforilación. En los últimos años, el eIF4E se ha descrito como un factor de pronóstico independiente asociado con la progresión maligna y el desarrollo de resistencia. Además, el eIF4E se encuentra sobreexpresado en cáncer de ovario, mama, pulmón, vejiga y próstata. La fosforilación del eIF4E es necesaria para la transformación tumoral pero es prescindible para el desarrollo normal. Por lo tanto, la inhibición farmacológica de las MNKs puede proporcionar una estrategia no tóxica y eficaz para el tratamiento del cáncer, especialmente en combinación con los tratamientos aprobados. En este proyecto, se proponen los sistemas pirazolo[3,4-b]piridínicos como posibles candidatos a inhibidores de MNK debido a su similitud con inhibidores conocidos. Se han estudiado las posibilidades sintéticas que ofrecen estas estructuras, definiendo metodologías generales para introducir sustituciones selectivas y controladas en 6 puntos diferentes de la molécula. Además, se han descrito los mecanismos de reacción. Se han estudiado 5 familias de compuestos basados en los compuestos pirazolo[3,4-b]piridínicos y una de las familias ha mostrado una actividad interesante en los ensayos preliminares. Se han identificado tres compuestos (EB1-3), con valores micromolares de IC50 (0.7 a 4 μM), que inhiben de forma completa y selectiva las MNKs (entre 2.5 y 5 μM) y sin presentar citotoxicidad en células de cáncer de mama triple negativo (MDA-MB-231). Además, el co-tratamiento con EB1 aumenta la sensibilidad de las células MDA-MB-231 a la doxorrubicina, mejorando su eficacia de inhibir el crecimiento celular. Se ha usado una estrategia de diseño basada en estructura para estudiar el mecanismo de interacción de los diferentes candidatos. Se han creado modelos de las formas activas e inactivas de MNK1 que se han usado para predecir el modo de unión de los hits. EB1 se ha definido como un inhibidor de tipo II que se une selectivamente la forma inactiva de MNK1 e interacciona con el motivo DFD (Asp-Phe-Asp), característico de las MNKs.Deregulation of protein synthesis is a common event in cancer. A key player in translational control is eIF4E whose function is modulated by the MAP kinase interacting kinases 1 and 2 (MNK1/2) through phosphorylation of a conserved serine (Ser209). In the recent years, eIF4E has been described as an independent prognostic factor associated with malignant progression and development of resistance. Moreover, eIF4E is found to be overexpressed in ovarian, breast, lung, colon, bladder and prostate cancer. eIF4E phosphorylation is necessary for oncogenic transformation while dispensable for normal development. Hence, pharmacologic MNK inhibitors may provide a non-toxic and effective anti-cancer strategy, especially in combination with approved treatments. In this project, the pyrazolo[3,4-b]pyridinic systems have been proposed as potential candidates as MNK inhibitors due to their similarity with known effective inhibitors. During this project, the synthetic possibilities offered by these scaffolds have been deeply studied defining general methodologies to achieve selective and controlled substitutions in 6 different points of the central core. Moreover, the reaction mechanisms have been described. Up to 5 families of compounds based on the pyrazolo[3,4-b]pyridine scaffold were studied and one of the families showed interesting activity on the preliminary assays. Three compounds (EB1-3), with IC50 values in the low μM range (0.7 to 4 μM), showed a complete and selective inhibition of MNKs (between 2.5 and 5 μM) and no significant cell toxicity in the triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231. Moreover, co-treatment with EB1 clearly increased the sensitivity of MDA-MB 231 cells to doxorubicin improving the efficacy of the drug in inhibiting cell growth. A structure-based drug design strategy was applied to understand the mechanism of interaction of the different candidates. Models of the active/inactive forms of MNK1 were created and used to predict the binding mode of the hits. EB1 seems to be a type II inhibitor which selectively binds to the inactive form of MNK1 and interacts with the DFD (Asp-Phe-Asp) motif, a unique feature of MNKs

C4-C5 fused pyrazol-3-amines: when the degree of unsaturation and electronic characteristics of the fused ring controls regioselectivity in Ullmann and acylation reactions

Pyrazol-3-amine is a scaffold present in a large number of compounds with a wide range of biological activities and, in many cases, the heterocycle is C4-C5 fused to a second ring. Among the different reactions used for the decoration of the pyrazole ring, Ullmann and acylation have been widely applied. However, there is some confusion in the literature regarding the regioselectivity of such reactions (substitution at N1 or N2 of the pyrazole ring) and no predictive rule has been so far established. As a part of our work on 3-amino-pyrazolo[3,4-b]pyridones 13, we have studied the regioselectivity of such reactions in different C4-C5 fused pyrazol-3-amines. As a rule of thumb, the Ullmann and acylation reactions take place, predominantly, at the NH and non-protonated nitrogen atom of the pyrazole ring respectively, of the most stable initial tautomer (1H- or 2H-pyrazole), which can be easily predicted by using DFT calculations

Overcoming Paradoxical Kinase Priming by a Novel MNK1 Inhibitor

Inhibidor de MNK1; OncologíaInhibidor de MNK1; OncologiaMNK1 inhibitor; OncologyTargeting the kinases MNK1 and MNK2 has emerged as a valuable strategy in oncology. However, most of the advanced inhibitors are acting in an adenosine triphosphate (ATP)-competitive mode, precluding the evaluation of different binding modes in preclinical settings. Using rational design, we identified and validated the 4,6-diaryl-pyrazolo[3,4-b]pyridin-3-amine scaffold as the core for MNK inhibitors. Signaling pathway analysis confirmed a direct effect of the hit compound EB1 on MNKs, and in line with the reported function of these kinases, EB1 only affects the growth of tumor but not normal cells. Molecular modeling revealed the binding of EB1 to the inactive conformation of MNK1 and the interaction with the specific DFD motif. This novel mode of action appears to be superior to the ATP-competitive inhibitors, which render the protein in a pseudo-active state. Overcoming this paradoxical activation of MNKs by EB1 represents therefore a promising starting point for the development of a novel generation of MNK inhibitors.This work was supported by the Instituto de Salud Carlos III (PI17/02247), (PI20/01687), and CIBERONC (CB16/12/00363). S.R.y.C. acknowledges support from the Generalitat de Catalunya (2017-9015-385045). E. Bou-Petit thanks the Secretaria d’Universitats i Recerca del Departament d’Economia i Coneixement de la Generalitat de Catalunya (2017 FI_B2 00139) and the European Social Funds for her predoctoral fellowship

An Unequivocal Synthesis of 2-Aryl Substituted 3-Amino-2,4,5,7-tetrahydro-6H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-6-ones

The reaction between pyridones (1) and substituted hydrazines 4 can afford two different regioisomeric pyrazolo[3,4-b]pyridin - 6-ones 2 and 3 depending on the initial substitution of the methoxy group and the direction of the cyclization. In the case of phenylhydrazine 4 (R3 = Ph), we have clearly shown that the treatment of pyridones 1a-d with 4 (R3 = Ph) in MeOH at temperatures below 1408C yields, independently of the nature and position of the substituents present in the pyridone ring, the open intermediates 7a-d. When the reaction is carried at 1408C under microwave irradiation, the corresponding 2-aryl substituted pyrazolo[3,4-b]pyridines 3a-d are always formed. We have experimentally determined, using DSC techniques, the activation energies of the two steps involved in the formation of 3: a) substitution of the methoxy group present in pyridones 1 with phenylhydrazine 4 (R3 = Ph) to afford intermediates 7 and b) cyclization of intermediates 7 to yield pyrazolopyridines 3. The results obtained, 15 and 42 kcal·mol 1 respectively, are in agreement with the experimental findings

Sensitizing triple negative breast cancer to approved therapies: Design, synthesis and biological activity of MNK inhibitors

La desregulació de la síntesi de proteïnes és comuna en càncer. Un factor clau en el control de la traducció de proteïnes és el factor d'inici de la traducció 4E (eIF4E) que es troba regulat per les cinases MNK1/2 (MAP kinase interacting kinases 1 i 2) mitjançant fosforilació. En els últims anys, l’eIF4E s'ha descrit com un factor de pronòstic independent associat amb la progressió maligna i el desenvolupament de resistència. A més, l’eIF4E es troba sobreexpressat en càncer d'ovari, mama, pulmó, bufeta i pròstata. La fosforilació de l'eIF4E és necessària per a la transformació tumoral però és prescindible per al desenvolupament normal. Per tant, la inhibició farmacològica de les MNKs pot proporcionar una estratègia no tòxica i eficaç per al tractament del càncer, especialment en combinació amb els tractaments aprovats. En aquest projecte, es proposen els sistemes pirazolo[3,4-b]piridínics com a possibles candidats a inhibidors de MNK degut a la seva similitud amb inhibidors coneguts. S'han estudiat les possibilitats sintètiques que ofereixen aquestes estructures, definint metodologies generals per introduir substitucions selectives i controlades en 6 punts diferents de la molècula. A més, s'han descrit els mecanismes de reacció. S'han estudiat 5 famílies de compostos basades en les pirazolo[3,4-b]piridines i una de les famílies ha mostrat una activitat interessant en els assajos preliminars. S'han identificat tres compostos (EB1-3), amb valors micromolars de IC50 (0.7-4 μM), que inhibeixen de forma completa i selectiva les MNKs (entre 2.5 i 5 μM) i sense presentar citotoxicitat en cèl·lules de càncer de mama triple negatiu (MDA-MB-231). A més, el co tractament amb EB1 augmenta la sensibilitat de les cèl·lules MDA-MB-231 a la doxorubicina, millorant la seva eficàcia d'inhibir el creixement cel·lular. S'ha fet servir una estratègia de disseny basada en estructura per estudiar el mecanisme d'interacció dels diferents candidats. S'han creat models de les formes actives i inactives de MNK1 que s'han fet servir per predir la manera d'unió dels candidats. EB1 s'ha definit com un inhibidor de tipus II que s'uneix selectivament la forma inactiva de MNK1 i interacciona amb el motiu DFD (Asp-Phe-Asp), característic de les MNKs.La desregulación de la síntesis de proteínas es común en cáncer. Un factor clave en el control de la traducción de proteínas es el factor de inicio de la traducción 4E (eIF4E) cuya función está modulada por las quinasas MNK1/2 (MAP kinase interacting kinases 1 y 2) mediante fosforilación. En los últimos años, el eIF4E se ha descrito como un factor de pronóstico independiente asociado con la progresión maligna y el desarrollo de resistencia. Además, el eIF4E se encuentra sobreexpresado en cáncer de ovario, mama, pulmón, vejiga y próstata. La fosforilación del eIF4E es necesaria para la transformación tumoral pero es prescindible para el desarrollo normal. Por lo tanto, la inhibición farmacológica de las MNKs puede proporcionar una estrategia no tóxica y eficaz para el tratamiento del cáncer, especialmente en combinación con los tratamientos aprobados. En este proyecto, se proponen los sistemas pirazolo[3,4-b]piridínicos como posibles candidatos a inhibidores de MNK debido a su similitud con inhibidores conocidos. Se han estudiado las posibilidades sintéticas que ofrecen estas estructuras, definiendo metodologías generales para introducir sustituciones selectivas y controladas en 6 puntos diferentes de la molécula. Además, se han descrito los mecanismos de reacción. Se han estudiado 5 familias de compuestos basados en los compuestos pirazolo[3,4-b]piridínicos y una de las familias ha mostrado una actividad interesante en los ensayos preliminares. Se han identificado tres compuestos (EB1-3), con valores micromolares de IC50 (0.7 a 4 μM), que inhiben de forma completa y selectiva las MNKs (entre 2.5 y 5 μM) y sin presentar citotoxicidad en células de cáncer de mama triple negativo (MDA-MB-231). Además, el co-tratamiento con EB1 aumenta la sensibilidad de las células MDA-MB-231 a la doxorrubicina, mejorando su eficacia de inhibir el crecimiento celular. Se ha usado una estrategia de diseño basada en estructura para estudiar el mecanismo de interacción de los diferentes candidatos. Se han creado modelos de las formas activas e inactivas de MNK1 que se han usado para predecir el modo de unión de los hits. EB1 se ha definido como un inhibidor de tipo II que se une selectivamente la forma inactiva de MNK1 e interacciona con el motivo DFD (Asp-Phe-Asp), característico de las MNKs.Deregulation of protein synthesis is a common event in cancer. A key player in translational control is eIF4E whose function is modulated by the MAP kinase interacting kinases 1 and 2 (MNK1/2) through phosphorylation of a conserved serine (Ser209). In the recent years, eIF4E has been described as an independent prognostic factor associated with malignant progression and development of resistance. Moreover, eIF4E is found to be overexpressed in ovarian, breast, lung, colon, bladder and prostate cancer. eIF4E phosphorylation is necessary for oncogenic transformation while dispensable for normal development. Hence, pharmacologic MNK inhibitors may provide a non-toxic and effective anti-cancer strategy, especially in combination with approved treatments. In this project, the pyrazolo[3,4-b]pyridinic systems have been proposed as potential candidates as MNK inhibitors due to their similarity with known effective inhibitors. During this project, the synthetic possibilities offered by these scaffolds have been deeply studied defining general methodologies to achieve selective and controlled substitutions in 6 different points of the central core. Moreover, the reaction mechanisms have been described. Up to 5 families of compounds based on the pyrazolo[3,4-b]pyridine scaffold were studied and one of the families showed interesting activity on the preliminary assays. Three compounds (EB1-3), with IC50 values in the low μM range (0.7 to 4 μM), showed a complete and selective inhibition of MNKs (between 2.5 and 5 μM) and no significant cell toxicity in the triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231. Moreover, co-treatment with EB1 clearly increased the sensitivity of MDA-MB 231 cells to doxorubicin improving the efficacy of the drug in inhibiting cell growth. A structure-based drug design strategy was applied to understand the mechanism of interaction of the different candidates. Models of the active/inactive forms of MNK1 were created and used to predict the binding mode of the hits. EB1 seems to be a type II inhibitor which selectively binds to the inactive form of MNK1 and interacts with the DFD (Asp-Phe-Asp) motif, a unique feature of MNKs

Chemical vs thermal accelerated hydrolytic degradation of 3D-printed PLLA/PLCL bioresorbable stents: Characterization and influence of sterilization

Bioresorbable stents (BRS) are designed to provide initial sufficient mechanical support to prevent vessel recoil while being degraded until their complete resorption. Therefore, degradation rate of BRS plays a crucial role in successful stent performance. This work presents a complete study on the degradation of poly-l-lactic acid (PLLA) and poly(lactic-co-ɛ-caprolactone) (PLCL) stents fabricated by solvent-cast direct-writing (SC-DW) through two different accelerated assays: alkaline medium at 37 °C for 10 days and PBS at 50 °C for 4 months. On retrieval, degraded stents were characterized in terms of mass loss, molecular weight (Mw), thermal and mechanical properties. The results showed that under alkaline conditions, stents underwent surface erosion, whereas stents immersed in PBS at 50 °C experienced bulk degradation. Mn decrease was accurately described by the autocatalyzed kinetic model, with PLCL showing a degradation rate 1.5 times higher than PLLA. Additionally, stents were subjected to γ-irradiation and ethylene oxide (EtO) sterilization. Whereas EtO-sterilized stents remained structurally unaltered, γ-irradiated stents presented severe deterioration as a result of extensive chain scission