Evaluation of the antifungal activity of Streptomyces sp. on Bipolaris sorokiniana and the growth promotion of wheat plants

Streptomyces sp. R18(6) and Streptomyces sp. 6(4) strains were evaluated for their ability to control brown spot and common root rot caused by Bipolaris sorokiniana in wheat crops. The antifungal activity of these isolates was tested using a double-layer assay and culture pairing at 28 °C. Physiological and enzymatic activity performed through siderophore, indole-3-acetic acid, nitrogen fixation and phosphate solubilization tests. The biocontrol of the disease and growth-promoting efficiency of wheat seedlings were assessed using in vivo assays in a greenhouse. In the culture pairing assays, both strains inhibited B. sorokiniana mycelial growth, while in the double-layer only Streptomyces sp. R18(6). Streptomyces sp. 6(4) produced auxin, siderophores, fixed nitrogen and solubilized phosphate, whereas R18(6) did not produce siderophores. In the greenhouse assays, strain R18(6) showed statistical differences in shoot dry mass and root dry mass compared with those of strain 6(4) in the presence of the phytopathogen (P ≤ 0.05), and these results were more evident when the environmental temperature was higher. In the absence of the phytopathogen, Streptomyces sp. 6(4) strain increased the root dry mass compared with that of the control during the same period. Therefore, these isolates can potentially control root rot and brown spotting and may promote the growth of wheat plants

Whole-genome sequencing-based characterization of Streptomyces sp. 6(4) : focus on natural product

We have sequenced the whole genome of Streptomyces sp. 6(4) isolated from tomato roots that presents antifungal activity against phytopathogenic fungi, mainly Bipolaris sorokiniana. The genome has almost 7Mb and 3368 hypothetical proteins that were analysed and characterized in Uniprot with the emphasis on biological compounds. Multilocus sequence typing (MLST) analyses were performed in an effort to characterize and identify this isolate, resulting in a new sequence type (ST), classified as ST64. Phenetic and phylogenetic trees were constructed to investigate Streptomyces sp. 6(4) evolution and sequence similarity, and the isolate is a strain closer to Streptomyces prasinus and Streptomyces viridosporus. It is known that the genus Streptomyces possess huge metabolic capacity with the presence of cryptic genes. These genes are usually present in clusters, which are responsible for the production of diverse natural products, mainly antibiotics. In addition, 6(4) showed 11 biosynthetic gene clusters through antiSMASH, including 3 polyketide synthase (PKS) and non-ribosomal peptide synthase (NRPS) type clusters

Characterization of actinobacterias isolates using BOX-PCR and URP-PCR and purification of a bioactive compound produced by an isolate of Streptomyces sp

O filo Actinobacteria é um importante grupo de bactérias Gram positivas amplamente distribuídas nos ambientes aquáticos e terrestres, são grandes produtores de compostos biologicamente ativos e, portanto, de grande interesse biotecnológico. O gênero Streptomyces destaca-se como maior produtor destes compostos, sendo responsável por cerca de 70% dos antibióticos que hoje utilizamos. A identificação dos organismos deste gênero ainda é um desafio. Durante muitos anos a identificação foi realizada somente com base em características morfológicas e fisiológicas. Atualmente, com o avanço das técnicas moleculares, há um grande número de espécies relatadas em bancos de dados genômicos. Este trabalho tem por objetivo identificar isolados de actinobactérias presentes no Laboratório de Microbiologia Ambiental ICBS/UFRGS com auxílio das técnicas de BOX-PCR, amplamente utilizado em estudos de diversidade dentro deste filo, e URP-PCR. E, além disso, realizar purificação parcial de um composto antimicrobiano efetivo contra bactérias produzido pelo isolado Streptomyces 8S. Os primers URP e BOX1AR produziram distintos padrões de amplificação nos isolados estudados, porém não foi possível investigar as relações de similaridade entre eles. Ainda o sequenciamento da região 16S rDNA não foi eficiente para identificar as espécies. Para a purificação do composto antimicrobiano foi realizada extração líquido-líquido com o solvente acetato de etila, posteriormente cromatografia de gel-filtração (Sephadex G-75) e troca iônica (SP-Sepharose e DEAE-celulose). A atividade antimicrobiana do composto foi recuperada após cada etapa. O composto manteve-se ativo após os ensaios de estabilidade frente à adição de EDTA, enzimas proteolíticas e altas temperaturas. Isto sugere que o composto antimicrobiano não é de origem protéica. Este trabalho sugere novos estudos a partir dos resultados preliminares obtidos, como a amplificação de todo o fragmento 16S rDNA dos isolados de actinobactérias e a investigação do composto antimicrobiano através de cromatografias de alta resolução.The Actinobacteria phylum is an important group of Gram positive bacteria widely distributed in terrestrial and aquatic environments. They are major producers of biologically active compounds and therefore of great biotechnological interest. The genus Streptomyces stands out as the largest producer of these compounds, accounting for about 70% of the antibiotics that we use today. The identification of these organisms is still a challenge. For many years the identification was carried out only based on morphological and physiology characteristics. Today, with the advance of molecular techniques, there are a large number of species reported in genomics database. This work aims to identify isolates of actinobacterias present in the Laboratório de Microbiologia Ambiental ICBS / UFRGS with the help of BOX-PCR techniques, widely used in diversity studies within this phylum, and URP-PCR. And besides that, performing partial purification of an antimicrobial compound effective against bacteria produced by Streptomyces 8S isolated. The URP and BOX1AR primers produced different amplification patterns in the isolates, but it was not possible to investigate the relationship of similarity between them. Also the sequencing of 16S rDNA was not efficient to identify the species. To purify the antimicrobial compound was carried out liquid-liquid extraction with the solvent ethyl acetate, subsequently chromatography: gel-filtration (Sephadex G-75) and ion exchange (SP-Sepharose and DEAE-cellulose). The antimicrobial in question did not adhere to the SP-Sepharose column, showing that it has negative charge. The antimicrobial activity of the compound was recovered after each step. The compound remained active after the stability tests like the addition of EDTA, proteolytic enzymes and high temperatures. This suggests that the antimicrobial compound is not a protein. This work suggests further studies based on the obtained preliminary results such as the amplification of the entire 16S rDNA of actinobacterias isolated fragment and the investigation of the antimicrobial compound using high resolution chromatography

Isolation, molecular identification and natural products in Streptomyces from Antarctic

Streptomyces é o gênero bacteriano mais promissor na pesquisa de produtos naturais, desde a Era de Ouro das descobertas de antibióticos até recentemente com a perspectiva dos grupos de genes crípticos de biossíntese. Entretanto, apesar do uso internacional do sequenciamento do gene 16S rRNA para identificação de espécies bacterianas, seu uso não discrimina as 750 espécies do gênero Streptomyces. Neste trabalho, o padrão de amplificação gerado por BOX-PCR e REP-PCR de 49 isolados de estreptomicetos de solo antártico foi comparado para avaliar a diversidade presente no grupo e para caracterizar os isolados bacterianos, além da amplificação dos genes 16S rRNA, rpoB, gyrB, recA, trpB e atpD. O primer BOX-A1R apresentou fragmentos mais claros, diferente dos padrões obtidos usando os primers REP 1R e 2R. Duas bases de dados foram utilizadas, GenBank e EzBioCloud, para comparar as sequências dos genes 16S das amostras. O banco de dados GenBank mostrou-se insuficiente para análise dos outros genes, devido à escassez de sequências depositadas. O isolado LMA323St_9 demonstrou ser potencialmente uma nova espécie a ser estudada. Além disso, o uso de genes housekeeping fornece informações filogenéticas robustas para o entendimento das relações dentro do grupo. Ainda, investigou-se os compostos antimicrobianos de 40 isolados, fermentação em microplacas e tubos foram usadas para testagem de 10 meios de cultura distintos e os extratos resultantes foram testados contra bactérias Gram-positivas e Gram negativas, fungos filamentosos e leveduras. Os extratos ativos foram analisados por LC-UV-LRMS e HRMS. Foram encontrados 14 compostos, incluíndo maltofilinas e alteramidas antifúngicas. Um isolado, identificado como LMA323St_43d, apresentou atividade antifúngica mas não foram encontrados compostos correspondentes nas bases de dados avaliadas. Este trabalho traz informações acerca de 49 isolados de Streptomyces com alto potencial antifúngico.Streptomyces is the most promising bacterial genera in natural products research, since the Golden Era of antibiotic discovery until the present time with the perspective of cryptic biosynthetic gene clusters. However, despite the worldwide use of 16S rRNA sequencing to identify bacterial species, the use of this gene does not discriminate the 750 species in the genus Streptomyces. In this work, amplification profiles generated from BOX-PCR and REP-PCR of 49 Antarctic soil streptomycetes were compared to evaluate the diversity present in the group and to characterize the bacterial isolates, along with 16S rRNA, rpoB, gyrB, recA, trpB and atpD amplifications. The BOX-A1R primer exhibit clearer amplification fragments, different from the patterns obtained using the REP 1R and 2R primers. It was used two different databases, GenBank and EzBioCloud, to compare the 16S sequences. There is a lack of deposited sequences in the other genes, as the data in GenBank proved to be insufficient. The results indicate that the use of housekeeping genes provides robust phylogenetic information, and isolate LMA323St_9 is potentially a novel species to be studied in the future. Besides that, the antimicrobial compounds produced by 40 isolates were investigated in microplates fermentations and tubes were used to test 10 different culture media and the resultant extracts were tested against Gram-negative and Gram-positive bacteria, filamentous fungi and yeasts. The active extracts were analyzed by LC-UVLRMS and HRMS. A number of 14 compounds were found, including the antifungals maltophilin and alteramide. One isolate identified as LMA323St_43d presents antifungal activity but no relative compound in the used mass spectrometry databases was found. This work brings information about the 49 Streptomyces isolates with great antifungal potential

Avaliação das condições ideais de crescimento para Streptomyces sp. : visando o potencial antimicrobiano

O presente trabalho avalia a atividade antimicrobiana de um isolado de Streptomyces 8S contra cepas de Enterococcus sp. e Staphylococcus sp. de origem clínica multirresistentes a antimicrobianos, visando a obtenção de condições otimizadas para a maior produção do composto antimicrobiano presente no isolado. Os ensaios de otimização da produção do composto foram realizados em cultura submersa, buscando a produção do extrato bruto e alternando diferentes fontes de carbono (sacarose ou amido), temperatura (30oC a 55oC, variando 5oC) e pH (5,0 a 10,0) do meio de cultivo. A atividade antimicrobiana do extrato foi avaliada através da técnica de difusão em poço. O isolado 8S apresentou maior atividade antimicrobiana frente as bactérias teste quando crescido com sacarose com fonte de carbono a uma temperatura de 30oC. No que se refere ao pH do meio de cultivo, observou-se que quando ocorreu o tamponamento para manutenção do pH determinado, o isolado apresentou maior atividade em pH 8,0. Sem a utilização de tampões no meio de cultivo, nenhum resultado foi superior àquele obtido com o tamponamento. Os resultados obtidos sugerem a produção de um composto com uma ótima atividade contra bactérias Gram-positivas multirresistentes e de grande importância nas infecções nosocomiais