Diversidad genética y patogenicidad a nivel de raíz en plántulas de soja de tres cultivares de cepas de Fusarium graminearum aisladas de rastrojos de maíz

Crops residues are an important source of maintenance of Fusarium graminearum inoculum in the soybean agroecosystem. Given that these populations can interact in the substrate through mechanisms of mycelial recognition and that they can come into direct contact with the implanted seed and cause disease, the following objectives were set: (1) to evaluate the genetic diversity through of the mycelial compatibility of F. graminearum strains isolated from maize crop residues; (2) to analyze the pathogenicity of F. graminearum strains isolated from crop residues towards soybean seedlings from different cultivars treated and untreated with fungicide. Mycelial compatibility studies showed a unique pattern of mycelial compatibility for each strain, indicating a great heterogeneity in the population evaluated. Pathogenicity tests in all strains tested were capable of causing symptoms of root rot with varying degrees of severity and reduc- tions in the height of seedlings. In the factorial statistical analysis, the greatest effect was marked by the soybean cultivar effect. A clear decline in the severity index was also observed with the fungicide application, so this would be a useful prevention tool to reduce the intensity in soybean seedling diseasesLos rastrojos de cultivos antecesores son una fuente importante de mantenimiento del inóculo de Fusarium graminearum en el agroecosistema de la soja. Teniendo en cuenta que estas poblaciones pueden interactuar en el sustrato a través de mecanismos de reconocimiento micelial y que las mismas pueden entrar en contacto directo con la semilla implantada y causar enfermedad, se plantearon los siguientes objetivos: (1) Evaluar la diversidad genética a través de la compatibilidad micelial en cepas de F. graminearum aisladas de rastrojos de maíz; (2) Analizar la patogenicidad de cepas de F. graminearum aisladas de rastrojos respecto de la podredumbre de raíz en plántulas de distintos cultivares de soja tratadas y no tratadas con fungicida curasemillas. Los estudios de compatibilidad micelial mostraron un único patrón de compatibilidad micelial para cada cepa, indicando una gran heterogeneidad en la población evaluada. En los ensayos de patogenicidad todas las cepas evaluadas fueron capaces de provocar síntomas de podredumbre de la raíz con distintos grados de severidad y reducciones en la altura de plántulas. El análisis estadístico factorial demostró que el mayor efecto observado en las variables independientes estuvo marcado por el efecto del cultivar de soja evaluado. También se observó una clara disminución en el índice de severidad con la aplicación de un fungicida curasemilla, por lo que esta sería una herramienta útil de prevención para disminuir la intensidad en las enfermedades de plántulas de soja.Fil: Bonacci, Martin Miguel. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Barros, Germán Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentin

Studies on possible modes of action and tolerance to environmental stress conditions of different biocontrol agents of foliar diseases in maize

The present study evaluates the possible modes of action of antagonistic bacteria and their tolerance to UV radiation, temperature and osmotic stress. The partial 16S-23S rRNA gene sequencing of eight antagonistic bacteria had a high match with three bacterial genera: Curtobacterium, Pantoea and Bacillus. In this study, the three Bacillus isolates showed the most relevant production of enzymes, volatile organic compounds and antibiosis against Exserohilum turcicum. Respect to UV radiation and temperature Pantoea and Bacillus isolates were more tolerant; whereas the eight isolates were tolerant to osmotic stress in varying degree. The three Bacillus isolates have the greatest potential as biocontrol agents for foliar diseases in maize. The antagonistic action could be explained through different modes of action such as enzymes, volatile organic compounds and/or direct antibiosis by other secondary metabolites. Bacillus isolates tolerance to environmental stresses including UV radiation, temperature and osmotic stress is relevant for survival and persistence on the leaf surface. This work provides new information about the mode of action of antagonistic bacteria with proven efficacy against maize leaf pathogens. In addition, it provides information about the tolerance of antagonistic bacteria against different stress conditions. The data of the present study could contribute to the development of a successful foliar biofungicide.Fil: Sartori, Melina Victoria. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Bonacci, Martin Miguel. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Barra, Paula Sabina. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Fessia, Alumine Soledad. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Etcheverry, Miriam Graciela. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Nesci, Andrea Verónica. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Barros, Germán Gustavo. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; Argentin

Efectos de dosis subletales de butil hidroxitolueno (BHT) contra Tribolium confusum (Jacquelin du Val), vector de Aspergillus flavus en maíz almacenado

Los antioxidantes y compuestos fenólicos sintéticos se han utilizado ampliamente para preservar y mantener la calidad, el valor nutritivo, el sabor y el color de los alimentos y productos para piensos. Entre los más utilizados se encuentran el butilhidroxianisol (BHA), el butilhidroxitolueno (BHT), el trihidroxibutirofenona (THB) y el propilparabeno (PP). En investigaciones previas, hemos demostrado la actividad insecticida de los antioxidantes BHA y BHT contra las principales plagas del maíz almacenado. El objetivo del presente trabajo fue obtener una aproximación sobre el efecto nocivo del BHT contra el insecto T. confusum, vector de A. flavus toxicogénico en maíz almacenado, evaluando: i) la actividad antialimentaria; ii) el efecto sobre el crecimiento del insecto y el consumo de alimento; iii) el potencial repelente y iv) el efecto sobre el contenido total de proteínas en el insecto. La evaluación de la actividad antifedante, el cálculo de los índices nutricionales del insecto y la evaluación de la repelencia se realizaron a través de ensayos de elección y no-elección; a partir de los cuales se determinó si los insectos consumían o no el alimento tratado. La pérdida de peso se calculó por las diferencias obtenidas a distintos tiempos. A través de la reacción de Biuret se detectaron y cuantificaron los niveles de proteínas. No se observaron fuertes efectos de disuasión del antioxidante evaluado. El índice de disuasión de alimentación fue del 41,6% con 1,48 ppm del antioxidante en el sustrato de maíz. Los experimentos mostraron que el insecto a menudo probó el alimento tratado, lo que sugiere que la reducción de la ingesta fue una consecuencia del rechazo después de cortos períodos de alimentación. Estos resultados son consistentes con los valores de repelencia obtenidos. La repelencia disminuye a medida que aumenta la concentración de BHT. A partir de una concentración de 6,36 ppm de BHT se redujo la masa corporal. La reducción registrada fue más de la mitad del peso inicial. Los insectos alimentados con una dieta que contenía BHT mostraron un índice ECI (Eficiencia de Conversión de alimentos Ingeridos) significativamente más bajo que los insectos de control, lo que indica que más alimento se metabolizó para obtener energía y menos se convirtió en masa corporal. El contenido de proteínas en presencia de dosis subletales de BHT no muestra diferencias estadísticamente significativas con respecto al control y los tiempos de exposición. BHT mostró efecto perjudicial contra adultos de T. confusum.Fil: Barra, Paula Sabina. Universidad Nacional de Rio Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología. Cátedra de Ecología Microbiana; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: García, Daiana. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología; ArgentinaFil: Bonacci, Martin Miguel. Universidad Nacional de Rio Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología. Cátedra de Ecología Microbiana; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Etcheverry, Miriam Graciela. Universidad Nacional de Rio Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología. Cátedra de Ecología Microbiana; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Barros, Germán Gustavo. Universidad Nacional de Rio Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología. Cátedra de Ecología Microbiana; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Nesci, Andrea Verónica. Universidad Nacional de Rio Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología. Cátedra de Ecología Microbiana; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaIV Reunión Conjunta de Sociedades de Biología de la República ArgentinaMendozaArgentinaSociedad de Biología de CuyoSociedad de Biología de CórdobaAsociación de Biología de TucumánSociedad Argentina de BiologíaSociedad de Biología de RosarioSociedad Chilena de Reproducción y Desarroll

Epiphytic bacteria to prevent maize foliar pathogens that impact on yield

Maize (Zea mays L.) is one of the most important cereal crops in Argentina. However, a negative factor is the emergence and re-emergence of some foliar diseases. The common rust caused by Puccinia sorghi and the northern leaf blight caused by Exserohilum turcicum are two foliar diseases that affect the crop. The leaf blight becomes important in maize sown in late December and January after wheat harvest. The residues on the soil surface and intense rainfall during the summer months and moderate temperatures favor the disease development. At present there is a lack of information about the life cycle of this fungal pathogen. Therefore it was necessary to study the influence of abiotic factors such as temperature and water potential on the growth of E. turcicum on different crop residues used in rotations with maize under no-till system cultivation. According to our results, soybean residues allowed the pathogen growth in a wide range of conditions compared to wheat and maize residue, providing an inoculum source for maize infections in subsequent season. The expansion of emerging and reemerging diseases require the development of prevention and control strategies. Biological control is presented as an alternative aimed to minimize yield losses caused by foliar diseases. The use of microorganisms that antagonize foliar pathogens is risk-free when these organisms come from the same ecosystem. To achieve the selection of a potential biocontrol agent it is important to consider the relationship between biological interactions and environmental stress factors. Our research began by selecting microbial isolates from phyllosphere of maize and examining, in vitro, their antagonistic activity against E. turcicum. Of 111 microbial isolates, 11 potencial biocontrol agents against the pathogen were selected. Subsequently, potential biocontrol agents were evaluated in planta, in greenhouse, in order to assess their effectiveness in reducing disease severity of northern leaf blight. Foliar application of different bacteria significantly reduced the leaf blight between 30-78% and 39-56% at 20 and 39 days respectively. It was necessary to carry out studies on putative mechanisms of action and tolerance to the environmental stress conditions of the different biocontrol agents. The partial 16S rRNA gene sequencing of antagonistic bacteria had a high match with three bacterial genera: Curtobacterium, Pantoea and Bacillus. Bacillus strains showed the most relevant production of enzymes, volatile organic compounds and antibiosis against E. turcicum. Respect to tolerance to UV radiation and temperature, Pantoea spp. and Bacillus spp. strains were more tolerant. A preliminary evaluation of natural incidence of the common rust and the northern leaf blight in maize after application of bacteria antagonists was conducted at field level. Plants treated with biological control agents showed significant reductions in the incidence of foliar diseases. In northern leaf blight the reduction was higher than 50% in plants treated with Bacillus spp. Moreover, grain yield was significantly higher as compared to control treatments. We understand that these studies involves a long way, in order to achieve a broad knowledge of the agroecosystem and understand the behavior of the pathogen to achieve an effective preventive strategy.Fil: Sartori, Melina Victoria. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología; ArgentinaFil: Barra, Paula Sabina. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología; ArgentinaFil: Bonacci, Martin Miguel. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología; ArgentinaFil: Etcheverry, Miriam Graciela. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología; ArgentinaFil: Barros, Germán Gustavo. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología; ArgentinaFil: Nesci, Andrea Verónica. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación en Micología y Micotoxicología; Argentin

Conyza bonariensis as an alternative host for Colletotrichum species in Argentina

Aims: This study investigated the diversity of Colletotrichum isolates recovered from Conyza bonariensis leaves through the use of morphological characteristics, growth rate, carbon sources utilization and phylogenetic analysis. Methods and Results: In all, 30 Colletotrichum isolates recovered from C. bonariensis leaves showing symptoms of disease were included in the present study. Based on the analysis of morphology and sequences, the isolates were distributed into six Colletotrichum species complexes. The concatenated alignment of GAPDH and ITS sequences showed that 20 out of 30 isolates were included in four species complexes which comprise the most important pathogens causing anthracnose in soybean or anthracnose and stalk rot in maize: C. truncatum, C. orchidearum, C. gloeosporioides and C. graminicola. The remaining 10 isolates were included in the C. boninense and C. destructivum species complexes or could not be assigned to any complex with the available information. Conclusion: Weeds belonging to genus Conyza are host to soybean and maize potential pathogenic species of Colletotrichum and could have a role as inoculum reservoir for cross contamination in the agroecosystem. Significance and Impact of the Study: The combined use of morphological, kinetics and physiological parameters of growth and phylogenetic analysis in Colletotrichum isolates from Conyza leaves allowed the detection of species complexes previously not identified in Argentina.Fil: Bonacci, Martin Miguel. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Formento, Ángela Norma. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Entre Ríos. Estación Experimental Agropecuaria Paraná; ArgentinaFil: Morales, M. C.. Universidad de Chile; ChileFil: Orlando, J.. Universidad de Chile; ChileFil: Ibañez, Fernando Julio. Universidad Nacional de Rio Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Instituto de Investigaciones Agrobiotecnológicas - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigaciones Agrobiotecnológicas; ArgentinaFil: Sartori, Melina Victoria. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Etcheverry, Miriam Graciela. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Nesci, Andrea Verónica. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; ArgentinaFil: Barros, Germán Gustavo. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Microbiología e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; Argentin

Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice

Objective-: Inflammatory processes and foam cell formation are key determinants in the initiation and progression of atherosclerosis. Electrophilic nitro-fatty acids, byproducts of nitric oxide-and nitrite-dependent redox reactions of unsaturated fatty acids, exhibit antiinflammatory signaling actions in inflammatory and vascular cell model systems. The in vivo action of nitro-fatty acids in chronic inflammatory processes such as atherosclerosis remains to be elucidated.Methods and results-: Herein, we demonstrate that subcutaneously administered 9-and 10-nitro-octadecenoic acid (nitro-oleic acid) potently reduced atherosclerotic lesion formation in apolipoprotein E-deficient mice. Nitro-fatty acids did not modulate serum lipoprotein profiles. Immunostaining and gene expression analyses revealed that nitro-oleic acid attenuated lesion formation by suppressing tissue oxidant generation, inhibiting adhesion molecule expression, and decreasing vessel wall infiltration of inflammatory cells. In addition, nitro-oleic acid reduced foam cell formation by attenuating oxidized low-density lipoprotein-induced phosphorylation of signal transducer and activator of transcription-1, a transcription factor linked to foam cell formation in atherosclerotic plaques. Atherosclerotic lesions of nitro-oleic acid-treated animals also showed an increased content of collagen and α-smooth muscle actin, suggesting conferral of higher plaque stability. Conclusion-: These results reveal the antiatherogenic actions of electrophilic nitro-fatty acids in a murine model of atherosclerosis.Fil: Rudolph, Tanja K.. University of Pittsburgh; Estados Unidos. University Heart Center Hamburg; AlemaniaFil: Rudolph, Volker. University of Pittsburgh; Estados Unidos. University Heart Center Hamburg; AlemaniaFil: Edreira, Martin Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. University of Pittsburgh; Estados UnidosFil: Cole, Marsha P.. University of Pittsburgh; Estados UnidosFil: Bonacci, Gustavo Roberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. University of Pittsburgh; Estados UnidosFil: Schopfer, Francisco J.. University of Pittsburgh; Estados UnidosFil: Woodcock, Steven R.. University of Pittsburgh; Estados UnidosFil: Franek, Andreas. University Heart Center Hamburg; AlemaniaFil: Pekarova, Michaela. Biology Centre of the Academy of Sciences of the Czech Republic; República ChecaFil: Khoo, Nicholas K. H.. University of Pittsburgh; Estados UnidosFil: Hasty, Alyssa H.. Vanderbilt University Medical Center; Estados UnidosFil: Baldus, Stephan. University Heart Center Hamburg; AlemaniaFil: Freeman, Bruce A.. University of Pittsburgh; Estados Unido

Effectiveness and safety of elbasvir/grazoprevir therapy in patients with chronic HCV infection: Results from the Spanish HEPA‐C real‐world cohort

In randomized controlled trials of patients with chronic HCV infection, elbasvir/grazoprevir (EBR/GZR) demonstrated high cure rates and a good safety profile. This study assessed the effectiveness and safety of EBR/GZR, with and without ribavirin, in a real‐world HCV patient cohort. HEPA‐C is a collaborative, monitored national registry of HCV patients directed by the Spanish Association for the Study of the Liver and the Networked Biomedical Research Centre for Hepatic and Digestive Diseases. Patients entered into HEPA‐C between December 2016 and May 2017, and treated with EBR/GZR with at least end‐of‐treatment response data, were included. Demographic, clinical and virologic data were analysed, and adverse events (AEs) recorded. A total of 804 patients were included in the study. The majority were male (57.9%), with a mean age of 60 (range, 19‐92) years. Genotype (GT) distribution was GT 1, 86.8% (1a, 14.3%; 1b, 72.5%); GT 4, 13.2% and 176 patients (21.9%) were cirrhotic. Overall, among 588 patients with available data, 570 (96.9%) achieved sustained virologic response at 12 weeks post‐treatment (SVR12). SVR12 rates by genotype were GT 1a, 97.7%; GT 1b, 98.6%; and GT 4, 98.1%. No significant differences in SVR12 according to fibrosis stage were observed. Eighty patients experienced an AE, resulting in treatment discontinuation in three. In this large cohort of patients with chronic HCV managed in a real‐world setting in Spain, EBR/GZR achieved high rates of SVR12, comparable to those observed in randomized controlled trials, with a similarly good safety profile.Peer reviewe

Deep-sequencing reveals broad subtype-specific HCV resistance mutations associated with treatment failure.

A percentage of hepatitis C virus (HCV)-infected patients fail direct acting antiviral (DAA)-based treatment regimens, often because of drug resistance-associated substitutions (RAS). The aim of this study was to characterize the resistance profile of a large cohort of patients failing DAA-based treatments, and investigate the relationship between HCV subtype and failure, as an aid to optimizing management of these patients. A new, standardized HCV-RAS testing protocol based on deep sequencing was designed and applied to 220 previously subtyped samples from patients failing DAA treatment, collected in 39 Spanish hospitals. The majority had received DAA-based interferon (IFN) α-free regimens; 79% had failed sofosbuvir-containing therapy. Genomic regions encoding the nonstructural protein (NS) 3, NS5A, and NS5B (DAA target regions) were analyzed using subtype-specific primers. Viral subtype distribution was as follows: genotype (G) 1, 62.7%; G3a, 21.4%; G4d, 12.3%; G2, 1.8%; and mixed infections 1.8%. Overall, 88.6% of patients carried at least 1 RAS, and 19% carried RAS at frequencies below 20% in the mutant spectrum. There were no differences in RAS selection between treatments with and without ribavirin. Regardless of the treatment received, each HCV subtype showed specific types of RAS. Of note, no RAS were detected in the target proteins of 18.6% of patients failing treatment, and 30.4% of patients had RAS in proteins that were not targets of the inhibitors they received. HCV patients failing DAA therapy showed a high diversity of RAS. Ribavirin use did not influence the type or number of RAS at failure. The subtype-specific pattern of RAS emergence underscores the importance of accurate HCV subtyping. The frequency of "extra-target" RAS suggests the need for RAS screening in all three DAA target regions