Molecular mechanisms involved in midbrain dopaminergic neuron migration during murine development

Midbrain dopaminergic (MbDA) neurons are located in the ventral tegmental area (VTA) and the substantia nigra (SN) and are involved in many brain functions including motor control, reward associated behavior and modulation of emotions. This thesis dissects the migratory routes and the molecular mechanisms underlying the migration of the subsets of MbDA neurons that form the SN and the VTA. Previous attempts to study the migration of MbDA neurons were hampered by the lack of markers for migrating SN and VTA neurons and the lack of a system to monitor their migration in real time. In this study, different MbDA progenitor populations, which give rise to either SN or medial VTA (mVTA) were heritably labeled using a genetic inducible fate mapping method and the changing position of their descendants was assesed at several stages during their migration phase. To monitor migrating MbDA neurons in real time, an organotypic slice culture system of the developing midbrain was established. In this culture system the migratory behaviour of distinct MbDN populations was characterized by time-lapse imaging of fluorescently labeled fate-mapped SN or mVTA neurons. Furthermore, to assess leading edge orientation, the morphology of MbDA neurons was characterized at several developmental stages by three dimensional imaging of whole brains. The results of this study reveal two distinct modes of MbDA migration: MbDA neurons destined for the SN migrate first radially from their progenitor domain to the forming mantle layer and subsequently switch to tangential migration to reach their final position in the lateral midbrain. In contrast, neurons destined to the mVTA mainly undergo radial migration. The data further show that components of the Reelin signaling pathway are specifically expressed in a lateral MbDA subpopulation during embryonic development. CXCR4, a chemokine receptor, is expressed in medially located MbDA neurons and its ligand, CXCL12, is expressed in the meninges surrounding the midbrain. Time-lapse imaging of migrating MbDA neurons in presence of Reelin blocking antibody and analysis of mice in which Reelin signaling was inactivated demonstrate that Reelin signaling regulates the speed and trajectory of tangentially migrating MbDA neurons and the formation of the SN. In contrast, inactivation of CXCR4/CXCL12 signaling leads to accumulation of MbDA neurons in dorsal aspects of the MbDA neuronal field suggesting that CXCR4/CXCL12 signaling might modulate the radial migration of MbDA neurons. This study provides a detailed characterization of the distinct migratory pathways taken by MbDA neurons destined for the SN or the mVTA and provides insight into the molecular mechanisms that control different modes of MbDA neuronal migration. These mechanistic insights might serve as a model that can be applied to understand the formation of other nuclei in the ventral brain, where the migration processes are less well understood than in the layered structures of the dorsal brain. Moreover, the results of this study might contribute to improving the in vitro production of MbDA neurons from induced pluripotent or embryonic stem cells by providing markers to identify different subtypes of MbDA neurons during their generation.Dopaminerge Mittelhirn-Neurone (MbDA Neurone) befinden sich im ventralen tegmentalen Areal (VTA) und der Substantia nigra (SN) und modulieren willkürliche Bewegungen, Belohnungsverhalten und Emotionen. Die vorliegende Doktorarbeit analysiert die Migrationswege und die molekularen Mechanismen, die für die Migration der Subpopulation von MbDA Neuronen wichtig sind, die sich zu der SN und dem VTA entwickeln. Bisherige Versuche, die Migration von MbDA Subpopulationen im Detail zu untersuchen, waren nur wenig erfolgreich, da weder Marker für migrierende SN und VTA Neurone noch ein experimentelles System für die Echtzeit-Beobachtung der MbDA Neurone etabliert waren. In der vorliegenden Studie wurden verschiedene MbDA Vorläuferpopulationen, die sich entweder zu MbDA Neuronen in der SN oder dem mittleren Teil des VTA entwickeln, mit Hilfe einer genetischen Methode zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten markiert. Zunächst wurden über mehrer Entwicklungsstadien die sich verändernden Positionen der so markierten MbDA Neurone bestimmt, um einen Einblick in ihre Migrationswege zu gewinnen. Um migrierende MbDA Neuronen direkt beobachten zu können, wurden organotypische Schnittkulturen des embryonalen Mittelhirns etabliert. In diesem Kultursystem wurde das Migrationsverhalten von fluoreszenzmarkierten SN oder VTA Neuronen mit Zeitraffer-Mikroskopie untersucht. Um die Orientierung der migrierenden Neurone zu analysieren, wurde die Morphologie von MbDA Neuronen zu mehreren Entwicklungsstadien durch dreidimensionale Bildgebung charakterisiert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass unterschiedliche MbDA Subpopulationen unterschiedliche Migrationsverhalten aufweisen: MbDA Neurone, die sich zur SN entwickeln, wandern zuerst radial von ihrer Vorläuferdomäne in die Mantelschicht. Anschließend migrieren sie tangential, um ihre endgültige Position im lateralen Mittelhirn zu erreichen. Dagegen wandern MbDA Neurone, die sich zum mittleren Teil des VTA entwickeln, hauptsächlich radial. Die vorliegenden Daten zeigen weiter, dass während der Embryonalentwicklung Komponenten des Reelin Signalwegs spezifisch in einer lateral gelegenen MbDA Population exprimiert sind. Hingegen ist CXCR4, ein Chemokinrezeptor, nur in medial gelegenen MbDA Neuronen exprimiert. Der CXCR4 Ligand CXCL12 wird in der Pia mater exprimiert, die das Mittelhirn umschliesst. Zeitraffer-Mikroskopie von migrierenden MbDA Neuronen in Gegenwart eines Reelin-inhibierenden Anitkörpers und die Analyse von Mäusen, in denen der Reelin-Signalweg inaktiviert wurde, zeigen, dass das Reelin-Signal die Geschwindigkeit und Bewegungsbahn tangential wandernder MbDA Neuronen und die Bildung der SN reguliert. Im Gegensatz dazu führt die Inaktivierung des CXCL12/CXCR4 Signalwegs zu einer Ansammlung von MbDA Neuronen im dorsalen Bereich des VTA. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der CXCR4/CXCL12 Signalweg die radiale Wanderung der MbDA Neuronen moduliert. Diese Studie charakterisiert die Migrationswege der MbDA Neurone, die sich zur SN oder dem mittleren Teil des VTA entwickeln und gibt Einblicke in die molekularen Mechanismen, die verschiedene Arten der MbDA Migration kontrollieren. Diese mechanistischen Erkenntnisse könnten als Modell dienen, um die Entstehung anderer, in Kernen organisierter ventraler Gehirnbereiche besser zu verstehen, da bisher Migrationsprozesse in ventralen Gehirnbereichen weit weniger gut verstanden werden als im dorsalen Gehirn, wo Neurone in Zellschichten organisiert sind. Schließlich könnten die Ergebnisse dieser Studie möglicherweise dazu beitragen, die in vitro Erzeugung von MbDA Neuronen aus induzierten pluripotenten oder embryonalen Stammzellen zu verbessern, da mit Hilfe der hier identifizierten Markern verschiedene Unterarten von MbDA Neuronen schon während ihrer Entstehung identifiziert werden könnten

Reelin and CXCL12 regulate distinct migratory behaviors during the development of the dopaminergic system

The proper functioning of the dopaminergic system requires the coordinated formation of projections extending from dopaminergic neurons in the substantia nigra (SN), ventral tegmental area (VTA) and retrorubral field to a wide array of forebrain targets including the striatum, nucleus accumbens and prefrontal cortex. The mechanisms controlling the assembly of these distinct dopaminergic cell clusters are not well understood. Here, we have investigated in detail the migratory behavior of dopaminergic neurons giving rise to either the SN or the medial VTA using genetic inducible fate mapping, ultramicroscopy, time-lapse imaging, slice culture and analysis of mouse mutants. We demonstrate that neurons destined for the SN migrate first radially and then tangentially, whereas neurons destined for the medial VTA undergo primarily radial migration. We show that tangentially migrating dopaminergic neurons express the components of the reelin signaling pathway, whereas dopaminergic neurons in their initial, radial migration phase express CXC chemokine receptor 4 (CXCR4), the receptor for the chemokine CXC motif ligand 12 (CXCL12). Perturbation of reelin signaling interferes with the speed and orientation of tangentially, but not radially, migrating dopaminergic neurons and results in severe defects in the formation of the SN. By contrast, CXCR4/CXCL12 signaling modulates the initial migration of dopaminergic neurons. With this study, we provide the first molecular and functional characterization of the distinct migratory pathways taken by dopaminergic neurons destined for SN and VTA, and uncover mechanisms that regulate different migratory behaviors of dopaminergic neurons

Heritable L1 retrotransposition in the mouse primordial germline and early embryo

LINE-1 (L1) retrotransposons are a noted source of genetic diversity and disease in mammals. To expand its genomic footprint, L1 must mobilize in cells that will contribute their genetic material to subsequent generations. Heritable L1 insertions may therefore arise in germ cells and in pluripotent embryonic cells, prior to germline specification, yet the frequency and predominant developmental timing of such events remain unclear. Here, we applied mouse retrotransposon capture sequencing (mRC-seq) and whole-genome sequencing (WGS) to pedigrees of C57BL/6J animals, and uncovered an L1 insertion rate of ≥1 event per eight births. We traced heritable L1 insertions to pluripotent embryonic cells and, strikingly, to early primordial germ cells (PGCs). New L1 insertions bore structural hallmarks of target-site primed reverse transcription (TPRT) and mobilized efficiently in a cultured cell retrotransposition assay. Together, our results highlight the rate and evolutionary impact of heritable L1 retrotransposition and reveal retrotransposition-mediated genomic diversification as a fundamental property of pluripotent embryonic cells in vivo