Generation of tick-borne encephalitis virus with mutations in the fusion protein E

Die Membranfusion ist ein essentieller Schritt im Infektionsprozess umhüllter Viren und wird durch spezifische membranverankerte virale Oberflächenproteine (Fusionsproteine) vermittelt. Auf Grund ihres molekularen Aufbaus werden diese Proteine in drei unterschiedliche strukturelle Klassen eingeteilt (Klasse I, II und III). Sie alle bewirken Fusion durch Konformationsänderungen, die durch Interaktionen mit der Wirtszelle (wie z.B. Rezeptorbindung oder sauren pH) ausgelöst werden, wobei vermutlich Protein-Protein Wechselwirkungen am Fusionsort beteiligt sind. Flaviviren sind umhüllte Viren, die eine Reihe von humanen Pathogenen umfassen wie Gelbfieber Virus, Dengue Virus, Japanische Enzephalitis Virus (JEV), West Nil Virus und Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus (FSMEV). Diese Viren dringen durch rezeptorvermittelte Endozytose und anschließende Fusion ihrer Membran und der endosomalen Membran in Wirtszellen ein. Das Hüllprotein E („envelope“), ein virales Klasse II Fusionsprotein, ist für den Fusionsprozess verantwortlich. Der saure pH Wert der Endosomen löst die konformationelle Reorganisation vom metastabilen E Homodimeren in post-Fusions-Trimere aus. Die Kristallstrukturen von löslichen verkürzten E Proteinen verschiederner Flaviviren, denen die sogenannte „Stamm“-Region und der doppelte Membrananker fehlen, wurden vor und nach der säure-induzierten Umlagerung geklärt. Bemerkenswert ist, dass das E Protein als einziges bekanntes virales Fusionsprotein einen doppelten Transmembrananker besitzt, der aus zwei antiparallel angeordneten Transmembranhelices (TM1 und TM2) besteht. Diese sind für das intrazelluläre Sortieren und Prozessieren des viralen Polyproteins erforderlich. Unter Verwendung von rekombinanten subviralen Partikeln (RSP) des FSME Virus, die verkürzte und chimäre (mit heterologen JEV TM Segmenten) Formen des E Proteins enthalten, konnte gezeigt werden, dass beide TM Helices für eine effiziente Fusion notwendig sind. Funktionelle Analysen wiesen darauf hin, dass TM Interaktionen offenbar zur Stabilität des post-Fusions-Trimer und zur Vervollständigung des Fusionsprozesses der beiden Membranen beitragen. Ziel dieser Diplomarbeit war es, die Bedeutung der Beobachtungen mit RSP TM Mutationen im infektiösen FSMEV System zu verifizieren. Hierfür wurden heterologe und chimäre Membrananker in infektiöse FSMEV cDNA Klone eingebracht. Rekombinante FSME Viren mit einem gänzlich heterologen TM Anker oder chimären TM Ankern zeigten eine dramatische Reduktion der spezifischen Infektiösität und eine starke Beeinträchtigung der Virusvermehrung. Dadurch war es nicht möglich, mutierte Viren in ausreichender Menge für in vitro Fusionsexperimente herzustellen. Die in dieser Diplomarbeit gewonnene Daten deuten darauf hin, dass Modifikationen der TM Helices im Virus nicht nur die Fusion beeinflussen, sondern auch zusätzliche Schritte des viralen Lebenszyklus wie Partikelaufbau („Assembly“) betreffen. Im zweiten Teil dieser Diplomarbeit sollte die Funktion von konservierten Histidinen im E Protein als pH Sensoren für die Flavivirus Membranfusion in infektiösen FSME Viren analysiert werden. Eine vorangegangene Studie unter Verwendung von FSMEV RSPs hatte gezeigt, dass ein Histidin an der Schnittstelle zwischen zwei Domänen für die saure pH-induzierte Einleitung der Fusion wichtig ist. Es wurde spekuliert, dass ein zweites Histidin in dieser Region (welches jedoch im RSP System nicht untersucht werden konnte) ebenfalls an diesem Prozess beteiligt sein könnte. Der Austausch eines dieser Histidine führte in FSME Viren zu einer 10-fachen Reduktion der Infektiosität der Mutanten im Vergleich zum Wildtyp und die Kombination der beiden Mutanten ergab sogar eine 100-fache Reduktion der Infektiosität. Die Produktion dieser Mutanten liefert nun die Grundlage für weitere Studien einschließlich der Analyse der spezifischen Infektiosität und Fusionsaktivität nach Virusproduktion im Großmaßstab, um die Funktion von Histidine als pH Sensoren im infektiösen System untersuchen zu können.Membrane fusion is a crucial step during the cell entry of enveloped viruses and is driven by specific membrane-anchored viral surface proteins (fusion proteins). According to their molecular architecture these proteins have been assigned to three different structural classes (class I, II, and III). They all drive fusion by conformational changes that are triggered by interactions with the host cell (such as receptor binding or exposure to acidic pH) and presumably involve protein-protein interactions at the fusion site. Flaviviruses are small enveloped viruses and comprise several human pathogens like yellow fever virus, dengue virus, Japanese encephalitis virus (JEV), West Nile virus, and tick-borne encephalitis virus (TBEV). These viruses enter the host cells by receptor mediated endocytosis followed by fusion in the endosome mediated by the envelope protein E, a class II viral fusion protein. The acidic pH in the endosome triggers the conformational reorganization from metastable pre-fusion E homodimers into post-fusion trimers. The crystal structures of truncated E proteins, lacking the so-called ‘stem’-region and the membrane anchor, are known in their pre- and post-fusion conformations. The E protein is the only known viral fusion protein with a double membrane anchor, consisting of two antiparallel transmembrane helices (TM1 and TM2), required for intracellular sorting and processing of the viral polyprotein. Using recombinant subviral particles (RSPs) of TBEV with truncated and chimeric forms of protein E (containing heterologous JEV TM segments) it was shown that both TM helices are essential for efficient fusion. Functional analyses demonstrated that TM interactions apparently contribute to the stability of the post-fusion trimer and the completion of the merger of the membranes. In this diploma thesis we were interested to assess the significance of the observations made with RSP TM mutations in the context of infectious virions, heterologous and chimeric membrane anchors were introduced into an infectious cDNA clone of TBEV. The studies revealed that recombinant TBE viruses with a completely heterologous TM anchor or chimeric TM anchors had dramatically reduced specific infectivities. They were also severely impaired in their virus growth properties thus prohibiting the production of sufficient amounts of mutant viruses for in vitro fusion experiments. The data obtained in this work suggest that modifications of the TM helices in the virus not only affected fusion, but also additional steps of the virus life cycle such as particle assembly. In the second part of this diploma thesis, the role of conserved histidines in the E protein as pH sensors for triggering flavivirus membrane fusion were analysed in the context of infectious TBEV. A previous study using TBEV RSPs revealed that one histidine at an interface between two domains was important for the acidic-pH-induced initiation of fusion and a second histidine at this interface (which could not be investigated with RSPs) was speculated to be also involved in this process. Replacement of these histidines in infectious TBE virions led to a 10-fold reduced infectivity of the mutants compared to wild type and the combination of both mutants yielded even a 100-fold reduced infectivity. The generation of these mutants now provides the basis for further experiments to analyze the pH sensor in an infectious system, including the determination of specific infectivities and fusion activities of the histidine mutants after up-scaling of virus productions

Transmembrane anchors of the structural flavivirus proteins and their role in virus assembly and maturation

Flaviviren sind kleine umhüllte Viren mit zwei membranassoziierten Proteinen (prM/M und E), die den Zusammenbau von Viruspartikeln („Assembly“) im endoplasmatischen Retikulum (ER) koordinieren. Virionen mit prM-E Heterodimeren an der Virusoberfläche, knospen als nicht-infektiöse unreife Partikel in das ER. Dieser Prozess wird durch laterale Wechselwirkungen zwischen prM-E Oligomeren, sowie durch noch unbekannte Wechselwirkungen mit dem Kapsid vermittelt. Diese Partikel werden dann durch den Exozytose-Weg der Zelle transportiert. Während des Transportes wird prM durch die zelluläre Protease Furin im Trans-Golgi-Netzwerk gespalten. Diese Spaltung spielt für die Umwandlung des Virus in seine reife infektiöse Form eine essentielle Rolle. Nach der Reifungsspaltung von prM bleibt M mit dem Virion assoziiert, wohingegen der pr-Teil nach der Freisetzung aus der Zelle vom Partikel dissoziiert. Als Nebenprodukt des Virusassembly werden Kapsid-freie subvirale Partikel (SP) durch laterale prM-E Wechselwirkungen gebildet. Diese SP bestehen ausschließlich aus einer Lipidmembran und den darin verankerten prM-E Proteinen. Der Transport durch die Zelle, sowie die Reifung und Freisetzung von SPn erfolgen in gleicher Weise wie bei Virionen. In dieser Doktorarbeit untersuchten wir die Wechselwirkungen innerhalb und/oder zwischen den einzigartigen doppelten Transmembranankern von E und prM/M sowie der einzelnen Transmembran-Domäne (TMD) des Kapsidproteins (C) im Assembly- und Reifungsprozess des Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME-Virus), einem der wichtigsten humanpathogenen Flaviviren. Dieses Virus ist eng verwandt mit den durch Stechmücken übertragenen Gelbfieber, Dengue, Zika, Japanische Enzephalitis (JE), und West Nil Viren. Die TMDn sind Überreste der Polyprotein-Prozessierung am ER und dienen als Stop-Transfersignale und interne Signalsequenzen. Unter Verwendung eines infektiösen Klons des FSME-Virus (TBEV) ersetzten wir die TMDn der Strukturproteine (E, prM/M, C) durch die homologen Elemente des verwandten JE-Virus (JEV) in unterschiedlichen Kombinationen. Dieser Ansatz sollte die Untersuchung von TMD-Interaktionen erlauben, ohne ihre Funktionen während der Prozessierung des Polyproteins zu beeinflussen. Zusätzliche Informationen wurden durch serielles Passagieren von ausgewählten Viren und der Identifizierung von kompensatorischen Mutationen erworben. Wir beobachteten, dass Wechselwirkungen zwischen TMDn von E zur effizienten Produktion und Freisetzung von infektiösen Viruspartikeln beitragen und damit an der Rekrutierung des Nukleokapsids beteiligt sein könnten. Störungen dieser Wechselwirkungen führten zur vermehrten Bildung von Kapsid-freien SP auf Kosten vollständiger Virionen. E TMD Interaktionen scheinen auch an der Umlagerung der Hüllproteine an der Virusoberfläche, die für die Virusreifung und Entstehung von infektiösen Viren entscheidend sind, beteiligt zu sein. Im Gegensatz dazu wurde keine Beteiligung von spezifischen Wechselwirkungen der TMD des C Proteins in diesen Prozessen nachgewiesen. Entgegen unserer Erwartungen führte der Austausch der TMDn von prM/M durch die entsprechenden Elemente von JE-Virus zur Beeinträchtigung der Proteinexpression. Das ist ein Hinweis darauf, dass diese Regionen bereits an essenziellen Interaktionen teilnehmen, die für Polyprotein-Synthese und/oder Prozessierung notwendig sind. Insgesamt liefern die in dieser Arbeit präsentierten Daten neue Einblicke in die verschiedenen Funktionen der TMDn der Strukturproteine während des Virusassembly- sowie des Reifungs-prozesses und erweitern damit das Verständnis ihrer Rolle im Lebenszyklus von Flaviviren.laviviruses are small enveloped viruses with two membrane-anchored proteins (prM/M, E) that orchestrate virus assembly in the endoplasmic reticulum (ER). Virions containing prM-E heterodimers bud as non-infectious immature particles into the ER. This process is executed by lateral interactions between multiple prM-E heterodimers and still unknown interactions with the nucleocapsid. These particles are then transported through the exocytic pathway of the cell. During this transit prM is cleaved by the cellular protease furin in the trans-Golgi network, which is necessary for the conversion of the virus into its mature infectious form. After the maturation cleavage of prM, M remains associated with the virion, and the pr part disassociates upon secretion from the cell. As a byproduct of virus assembly, capsid-less subviral particles (SPs) containing only prM-E anchored in a lipid membrane are formed by lateral prM-E interactions. Cell transit, maturation and egress of SPs occur in the same manner as for virions. In this PhD thesis, we studied the interactions within and/or between the unique double transmembrane anchors of E and prM/M as well as the single transmembrane domain (TMD) of the capsid protein (C) in the assembly as well as maturation processes of one of the major human pathogenic flaviviruses, tick-borne-encephalitis (TBE) virus. This virus is closely related to the mosquito-borne yellow fever, dengue, Zika, Japanese encephalitis (JE), and West Nile viruses. The TMDs are remnants of polyprotein processing at the ER and function as stop-transfer signals as well as internal signal sequences. Using an infectious clone of TBE virus (TBEV) we replaced the TMDs of the structural proteins (E, prM/M, C) by the homologous counterparts of the related JE virus (JEV) in different combinations. This approach should have allowed the investigation of TMD interactions without affecting their functions in polyprotein processing. Further information was acquired by serial passaging of selected viruses and the identification of compensatory mutations. We found that contacts involving the TMDs of E are necessary for efficient morphogenesis and secretion of infectious virions and might contribute to the recruitment of the viral capsid. Disturbances of these TMD interactions favored the generation of capsid-less SPs at the cost of whole virus particles. E TMD interactions also seem to be crucial for the reorganization of the virus surface during virus maturation and the morphogenesis of infectious virions. In contrast, an involvement of specific interactions of the TMD of the C protein in these processes was not identified. Unexpectedly, the replacement of the TMDs of prM/M by their counterpart of JE virus impaired protein expression suggesting that these regions are already involved in crucial interactions necessary for polyprotein synthesis and/or processing. Overall the data presented in this PhD thesis provide new insights into the various functions of the TMDs of the structural proteins in assembly as well as maturation and thus extend previous knowledge of their roles in the life cycle of flaviviruses.submitted by Mag. rer. nat. Janja BlazevicZusammenfassung in deutscher SpracheAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016OeBB(VLID)192329