Immunogenicity and allergenicity of 2S, 7S and 11S soy protein fractions

Sabe-se que uma parte da população, principalmente crianças, são hipersensíveis à proteína de soja, embora não esteja completamente esclarecido qual a fração protéica mais alergênica. O objetivo do estudo foi comparar a imunogenicidade e alergenicidade das frações protéicas 2S (conglicinina), 7S (beta conglicinina) e 11S (glicinina) da soja, isoladas por cromatografia de afinidade. Essas frações protéicas foram usadas como antígenos para imunizar camundongos BALB/c e avaliar sua imunogenicidade pela produção de anticorpos IgM e IgG por ELISA. A alergenicidade dessas frações foi avaliada de acordo com os seguintes procedimentos: i) produção de anticorpos IgE contra as três frações protéicas por camundongos BALBc pelo teste de anafilaxia cutânea passiva (PCA) e ii) produção de anticorpos IgG1 contra a fração 7S em camundongos BALB/c por ELISA. As frações 7S e 11S induziram a formação de anticorpos IgM e IgG. O teste de PCA mostrou que somente a fração 7S foi alergênica pela produção de anticorpos IgE. A fração protéica 7S induziu a formação de anticorpos IgG1 em camundongos imunizados com essa fração. Nosso estudo mostra que a fração protéica 7S da soja é importante para desencadear reações alérgicas em camundongos e pode contribuir para esclarecer a alergenicidade dos produtos derivados da soja.It is known that in a part of the population, mainly among children, some are hypersensitive to soybean protein, although it is not yet completely elucidated which protein fraction is more immunogenic/allergenic. The objective of the study was to compare the immunogenicity and allergenicity of the soy protein fractions. The 2S (conglycinin), 7S (beta conglycinin) and 11S (glycinin) fractions were isolated from soy protein by affinity chromatography. These purified soy protein fractions were used as antigens for immunizing BALB/c mice to evaluate their immunogenicity by following the appearance of specific IgM and IgG antibodies in blood serum by ELISA. The allergenicity of these soy protein fractions was evaluated by the following approaches: i) the production of IgE antibodies against 2S, 7S and 11S soy protein fractions by BALBc mice in the anaphylactic cutaneous passive test (PCA), and ii) the production of IgG1 specific antibodies against the 7S fraction in BALB/c mice. The 7S and 11S fractions induced the formation of IgM and IgG antibodies. The PCA test showed that only the 7S fraction was allergenic leading to the production of IgE antibodies. Another evidence that reinforces the allergenicity of the 7S soy protein fraction is the presence of IgG1 specific antibodies reactive to this protein fraction in immunized mice. Our study shows that the 7S soy protein fraction is important to elicit allergic reactions in mice and may contribute to elucidate the allergenicity of soy-derived products

Determination of allergenic components isolated soy protein

O objetivo deste trabalho foi esclarecer qual das frações protéicas da soja é mais alergênica, avaliando-se sua imunogenicidade e alergenicidade por imunoensaios e teste de anafilaxia cutânea passiva. Além desse propósito, este estudo visou a produção de anticorpos monoclonais para utilizá-lo como ferramenta na padronização de um ensaio imunoenzimático com a finalidade de detectar proteínas da soja, em produtos comercializados. A purificação das frações 2S,7S e 11S da soja foi realizada com base em estudos prévios, padronizando-se a metodologia dentro das condições experimentais do laboratório. A constatação da pureza foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (gel de empilhamento a 5% e de separação em gradiente de 7 a 15%), onde se verificou as bandas protéicas características de cada fração. Evidenciou-se as subunidades α (63,17 KDa) α\' (58,06 KDa) e β (42,09 KDa), correspondentes à fração 7S da soja e as subunidades ácida (38,8 KDa) e básica (21,04 KDa), correspondentes à fração 11S da soja. A fração 2S da soja mostrou uma banda protéica de 20 KDa, nesse ensaio. Os resultados da cinética demonstraram que as frações 7S e 11S da soja são muito imunogênicas, visto que induziram uma grande produção de anticorpos das classes IgM e IgG, em camundongos BALB/c. Por outro lado, a fração 2S da soja induziu uma pequena produção de anticorpos IgG, principalmente no 30º dia após a imunização. No teste de anafilaxia cutânea passiva, quando se avaliou a capacidade das frações protéicas da soja de induzirem a produção de anticorpos IgE, em camundongos BALB/c, verificou-se que a fração 7S da soja é alergênica, nesse modelo experimental. Entretanto, as frações 2S e 11S não estimularam o sistema imunológico desses animais a produzir essa classe de anticorpo. Quando se investigou a presença de anticorpos IgE dirigidos contra as frações protéicas 2S, 7S e 11S da soja, no soro de pacientes alérgicos, obteve-se resultado negativo com todas as três proteínas estudadas. Entretanto, na análise da presença de IgG, tanto o soro dos pacientes alérgicos como o dos controles mostraram-se reativos às frações 2S e 7S da soja, sugerindo a presença do anticorpo IgG4 anafilático no soro teste. Os quatro anticorpos monoclonais reativos às frações 7S e 11S da soja, obtidos neste estudo, mostraram-se reativos até as diluições 1/8000 (2A8 e 1H4) e 1/10000 (1F9) para a fração 7S e 1/12000 (3F2) para a fração 11S da soja. A identificação dos determinantes antigênicos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais foi realizado por Imunotransferência. Observou-se que os anticorpos monoclonais anti-fração protéica 7S da soja (1H4, 2A8 e 1F9) reconheceram as subunidades α, α e β (1F9), α\' e β (1H4) e β (2A8), além de outras proteínas. Por outro lado, o anticorpo monoclonal anti-fração protéica 11S da soja (3F2) reagiu apenas com a subunidade básica dessa proteína. A padronização do ensaio imunoenzimático com o objetivo de detectar proteínas de soja, em produtos comercializados, mostrou que os anticorpos monoclonais dirigidos contra as frações protéicas 7S e 11S reconhecem, apenas, as proteínas da soja. Em conclusão, esses resultados sugerem que as frações protéicas 7S e 11S da soja são imunogênicas em camundongos, enquanto que na espécie humana, essa resposta foi observada com as frações 2S e 7S da soja. No teste de anafilaxia cutânea passiva, a fração protéica 7S da soja mostrou a capacidade de induzir anticorpos da classe IgE em camundongos BALB/c, sugerindo que essa fração é alergênica nesse ensaio. Por outro lado, os anticorpos monoclonais reativos às frações 7S e 11S detectaram as proteínas da soja nos produtos comercializados testados.The goal of this study was to elucidate which of the soy protein fractions is more allergenic by using enzyme immunoassays and passive cutaneous anaphylactic activity test. Furthermore, monoclonal antibodies were obtained in order to standardize immunoassays to detect soy protein fractions in commercial soy-derived products. Purification of 2S, 7S and 11S fractions from soy was based on previous studies which were adapted to our experimental conditions. Purity of the isolated fractions was determined by polyacrilamide gel electrophoresis (7-15%). The subunits α (63,17 KDa) α\' (58,06 KDa) and β (42,09 KDa), corresponding to 7S fraction as well as the acid (38,8 KDa) and basic (21,04 Kda) subunits of 11S fraction were visualized. The 2S fraction showed a 20 KDa band only. Data showed that the 7S and 11S soy fractions are immunogenic as they elicited IgM and IgG antibodies in BALB/c mice. In contrast, the 2S fraction was not immunogenic in this specie. The passive cutaneous anaphylactic activity test showed that 7S fraction is allergenic as it elicited IgE production in BALC mice. However, this test was negative for 2S and 7S fractions. No IgE reactive against the 2S, 7S e 11S was found in sera of patients (n=5) presenting previous food allergy symptoms. However, either these patients or controls (n=5) showed IgG reactive against 2S and 7S fractions in their sera. The four monoclonal antibodies obtained in this study were reactive up to 1/8000 (2A8 and 1H4) and 1/10000 (1F9) against 7S fraction, and up to 1/12000 (3F2) for 11S fraction. Immunoblot analysis showed that the monoclonal antibodies anti-7S fraction (1H4, 2A8 e 1F9) recognized the α α\' and β (1F9), α\' and β (1H4) and α (2A8) subunits. The monoclonal antibody anti-11S fraction (3F2) reacted with the basic subunit of this fraction only. By using ELISA and the monoclonal antibodies anti-7S and anti-11S it was possible to detect especifically these soy protein fractions in commercial soy-derived products. In conclusion, data suggest that 7S and 11S soy protein fractions are immunogenic in mice while 2S and 7S fraction are immunogenic in humans. The IgE response to 7S fraction in BALB/c mice showed by the passive cutaneous anaphylactic activity test indicates that this soy protein fraction is allergenic in this experimental model. Finally, the monoclonal antibodies anti-7S and anti-11S obtained in this study did not react with other vegetable or animal proteins being suitable to be used in ELISA for detection of these proteins in commercial soy-derived products

Determination of allergenic components isolated soy protein

O objetivo deste trabalho foi esclarecer qual das frações protéicas da soja é mais alergênica, avaliando-se sua imunogenicidade e alergenicidade por imunoensaios e teste de anafilaxia cutânea passiva. Além desse propósito, este estudo visou a produção de anticorpos monoclonais para utilizá-lo como ferramenta na padronização de um ensaio imunoenzimático com a finalidade de detectar proteínas da soja, em produtos comercializados. A purificação das frações 2S,7S e 11S da soja foi realizada com base em estudos prévios, padronizando-se a metodologia dentro das condições experimentais do laboratório. A constatação da pureza foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (gel de empilhamento a 5% e de separação em gradiente de 7 a 15%), onde se verificou as bandas protéicas características de cada fração. Evidenciou-se as subunidades α (63,17 KDa) α\' (58,06 KDa) e β (42,09 KDa), correspondentes à fração 7S da soja e as subunidades ácida (38,8 KDa) e básica (21,04 KDa), correspondentes à fração 11S da soja. A fração 2S da soja mostrou uma banda protéica de 20 KDa, nesse ensaio. Os resultados da cinética demonstraram que as frações 7S e 11S da soja são muito imunogênicas, visto que induziram uma grande produção de anticorpos das classes IgM e IgG, em camundongos BALB/c. Por outro lado, a fração 2S da soja induziu uma pequena produção de anticorpos IgG, principalmente no 30º dia após a imunização. No teste de anafilaxia cutânea passiva, quando se avaliou a capacidade das frações protéicas da soja de induzirem a produção de anticorpos IgE, em camundongos BALB/c, verificou-se que a fração 7S da soja é alergênica, nesse modelo experimental. Entretanto, as frações 2S e 11S não estimularam o sistema imunológico desses animais a produzir essa classe de anticorpo. Quando se investigou a presença de anticorpos IgE dirigidos contra as frações protéicas 2S, 7S e 11S da soja, no soro de pacientes alérgicos, obteve-se resultado negativo com todas as três proteínas estudadas. Entretanto, na análise da presença de IgG, tanto o soro dos pacientes alérgicos como o dos controles mostraram-se reativos às frações 2S e 7S da soja, sugerindo a presença do anticorpo IgG4 anafilático no soro teste. Os quatro anticorpos monoclonais reativos às frações 7S e 11S da soja, obtidos neste estudo, mostraram-se reativos até as diluições 1/8000 (2A8 e 1H4) e 1/10000 (1F9) para a fração 7S e 1/12000 (3F2) para a fração 11S da soja. A identificação dos determinantes antigênicos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais foi realizado por Imunotransferência. Observou-se que os anticorpos monoclonais anti-fração protéica 7S da soja (1H4, 2A8 e 1F9) reconheceram as subunidades α, α e β (1F9), α\' e β (1H4) e β (2A8), além de outras proteínas. Por outro lado, o anticorpo monoclonal anti-fração protéica 11S da soja (3F2) reagiu apenas com a subunidade básica dessa proteína. A padronização do ensaio imunoenzimático com o objetivo de detectar proteínas de soja, em produtos comercializados, mostrou que os anticorpos monoclonais dirigidos contra as frações protéicas 7S e 11S reconhecem, apenas, as proteínas da soja. Em conclusão, esses resultados sugerem que as frações protéicas 7S e 11S da soja são imunogênicas em camundongos, enquanto que na espécie humana, essa resposta foi observada com as frações 2S e 7S da soja. No teste de anafilaxia cutânea passiva, a fração protéica 7S da soja mostrou a capacidade de induzir anticorpos da classe IgE em camundongos BALB/c, sugerindo que essa fração é alergênica nesse ensaio. Por outro lado, os anticorpos monoclonais reativos às frações 7S e 11S detectaram as proteínas da soja nos produtos comercializados testados.The goal of this study was to elucidate which of the soy protein fractions is more allergenic by using enzyme immunoassays and passive cutaneous anaphylactic activity test. Furthermore, monoclonal antibodies were obtained in order to standardize immunoassays to detect soy protein fractions in commercial soy-derived products. Purification of 2S, 7S and 11S fractions from soy was based on previous studies which were adapted to our experimental conditions. Purity of the isolated fractions was determined by polyacrilamide gel electrophoresis (7-15%). The subunits α (63,17 KDa) α\' (58,06 KDa) and β (42,09 KDa), corresponding to 7S fraction as well as the acid (38,8 KDa) and basic (21,04 Kda) subunits of 11S fraction were visualized. The 2S fraction showed a 20 KDa band only. Data showed that the 7S and 11S soy fractions are immunogenic as they elicited IgM and IgG antibodies in BALB/c mice. In contrast, the 2S fraction was not immunogenic in this specie. The passive cutaneous anaphylactic activity test showed that 7S fraction is allergenic as it elicited IgE production in BALC mice. However, this test was negative for 2S and 7S fractions. No IgE reactive against the 2S, 7S e 11S was found in sera of patients (n=5) presenting previous food allergy symptoms. However, either these patients or controls (n=5) showed IgG reactive against 2S and 7S fractions in their sera. The four monoclonal antibodies obtained in this study were reactive up to 1/8000 (2A8 and 1H4) and 1/10000 (1F9) against 7S fraction, and up to 1/12000 (3F2) for 11S fraction. Immunoblot analysis showed that the monoclonal antibodies anti-7S fraction (1H4, 2A8 e 1F9) recognized the α α\' and β (1F9), α\' and β (1H4) and α (2A8) subunits. The monoclonal antibody anti-11S fraction (3F2) reacted with the basic subunit of this fraction only. By using ELISA and the monoclonal antibodies anti-7S and anti-11S it was possible to detect especifically these soy protein fractions in commercial soy-derived products. In conclusion, data suggest that 7S and 11S soy protein fractions are immunogenic in mice while 2S and 7S fraction are immunogenic in humans. The IgE response to 7S fraction in BALB/c mice showed by the passive cutaneous anaphylactic activity test indicates that this soy protein fraction is allergenic in this experimental model. Finally, the monoclonal antibodies anti-7S and anti-11S obtained in this study did not react with other vegetable or animal proteins being suitable to be used in ELISA for detection of these proteins in commercial soy-derived products