Reporter Assay for Endo/Lysosomal Escape of Toxin-Based Therapeutics

Protein-based therapeutics with cytosolic targets are capable of exhibiting their therapeutic effect once they have escaped from the endosomes or lysosomes. In this study, the reporters—horseradish peroxidase (HRP), Alexa Fluor 488 (Alexa) and ricin A-chain (RTA)—were investigated for their capacity to monitor the endo/lysosomal escape of the ribosome-inactivating protein, saporin. The conjugates—saporin-HRP, Alexasaporin and saporin-KQ-RTA—were constructed, and the endo/lysosomal escape of these conjugates alone (lack of endo/lysosomal release) or in combination with certain structurally-specific triterpenoidal saponins (efficient endo/lysosomal escape) was characterized. HRP failed in reporting the endo/lysosomal escape of saporin. Contrastingly, Alexa Fluor 488 successfully allowed the report of the process at a toxin concentration of 1000 nM. In addition, single endo/lysosome analysis facilitated the determination of the amount of Alexasaporin released from each vesicle. RTA was also successful in reporting the endo/lysosomal escape of the enzymatically inactive mutant, saporin-KQ, but in this case, the sensitivity of the method reached a toxin concentration of 10 nM. In conclusion, the simultaneous usage of Alexa Fluor 488 and RTA as reporters may provide the possibility of monitoring the endo/lysosomal escape of protein-based therapeutics in the concentration range of 10–1000 nM. View Full-Tex

Wirksamkeit von Dianthin-basierten Target-Toxinen in einem Pankreaskarzinom- Mausmodell

Targeted tumor therapy provides the rationale for the arrest of tumor growth in aggressive pancreatic carcinoma, however, a number of protein-based targeted toxins lack efficacy due to insufficient endosomal escape after being endocytosed. The main objective of this work was to test two disparate targeted toxins comprising the same ribosome-inactivating protein dianthin in both, however, targeting two different pathways. One contained human epidermal growth factor whereas the other contained dendritic polyglycerol sulfates. Both were tested in combination with a glycosylated triterpene (SO1861) that serves as an endosomal escape enhancer. In vitro investigations with the epidermal growth factor receptor (BxPC-3) and organic anion transporting polypeptide overexpressing (QGP-1) pancreatic carcinoma cell lines revealed no significant differences to off-target cells in the half maximal inhibitory concentration (IC50) for the dianthin-based targeted toxins. In contrast, combination with SO1861 decreased the IC50 for BxPC-3 cells from 100 nM to 0.17 nM in case of the fusion protein whereas control cells remained unaffected. However, a phenomenal augmentation of the cytotoxicity was observed from an IC50 of 1 nM to 10 fM when cells were treated with dianthin- dPGS in combination with enhancer. Monotherapy of BxPC-3 xenografts with dianthin-EGF (DE) in CD-1 nude mice led to a 50.1% average reduction in tumor volume (40.8 mm3) when compared to placebo, however, combined treatment with SO1861 resulted in a more than 13.6-fold better efficacy (3.0 mm3 average tumor size) with complete regression in 80% of the cases. Moreover, monotherapy of dianthin-dPGS led to 81.4 % average reduction in tumor volume (15.2 mm3) when compared to placebo. Nevertheless, dianthin-dPGS resulted in 2.6-fold better efficacy than DE, however, was 5-fold less efficacious than the combination treatment of DE with enhancer. Immunohistochemical analyses showed that tumor cells with lower target receptor expression are, in contrast to the combination therapy, able to escape from the monotherapy, which finally results in tumor growth. At the effective concentration we did not observe liver toxicity and no other side effects with the exception of a reversible skin hardening at the SO1861 injection site. Increase in platelet counts, plateletcrit and platelet distribution width were observed in fusion protein targeted therapy whereas elevation in alanine transaminase in dianthin-dPGS targeted therapy. In conclusion, combining a targeted toxin with SO1861 is proven to be a very promising approach for pancreatic cancer treatment. I would also conclude that dPGS-targeting of a transporter is a valuable alternative to classical ligand-receptor targeting.Eine zielgerichtete Tumortherapie bietet sich als vielversprechende Methode zur Hemmung des Tumorwachstums und Reduktion bei aggressivem Pankreaskarzinom an. Jedoch zeigt eine Vielzahl proteinbasierter Toxine nur eine begrenzte Effektivität aufgrund einer unspezifischen endosomalen Freisetzung. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, zwei zielgerichtete Toxine zu untersuchen, welche zum einen aus dem Ribosomen-inaktivierenden Protein Dianthin, zum anderen aus zwei verschiedenen Zielmolekülen, bestehen. Zum einen wurde der menschliche epidermale Wachstumsfaktor (EGFR), zum anderen dendritische Polyglycerinsulfate mit dem Dianthin fusioniert und mit einem glykosylierten Triterpen (SO1861) kombinierend getestet. Dabei wirkt SO1861 verstärkend auf die endosomale Freisetzung. In-vitro-Untersuchungen mit den EGFR (BxPC-3) und OATP-überexprimierenden (QGP-1) Pankreaskarzinom-Zelllinien zeigten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC & sub5; & sub0;) zwischen nicht-zielgerichteten Zellen und Zellen mit Dianthin basierenden, zielgerichteten Toxinen. Im Gegensatz dazu verringerte sich in Kombination mit SO1861 die IC50 für BxPC-3-Zellen von 100 nM auf 0,17 nM, wogegen die Kontrollzellen keine Veränderungen zeigten. Des Weiteren konnte in Zellen mit Dianthin-dPGS und SO1861 eine große Erhöhung der Zytotoxizität von 1 nM bis 10 fM beobachtet werden. Die Monotherapie von BxPC-3-Xenotransplantaten mit Dianthin-EGF (DE) in CD-1-Nacktmäusen führte im Vergleich zum Placebo zu einer durchschnittlichen Reduktion des Tumorvolumens um 50,1% (40,8 mm3). In kombinierter Behandlung mit SO1861 konnte eine 13,6-fache Reduktion (3,0 mm3, durchschnittliche Tumorgröße) mit vollständiger Regression in 80% der Fälle erzielt werden. Darüber hinaus führte die Monotherapie von Dianthin-dPGS zu einer durchschnittlichen Verringerung des Tumorvolumens um 81,4% (15,2 mm3) im Vergleich zum Placebo. Zugegebenermaßen führte die Behandlung mit Dianthin-dPGS zu einer 2,6-fach höheren Wirksamkeit als DE, jedoch zeigte die Kombinationsbehandlung von Dianthin-dPGS mit SO1861 eine 5-fach geringere Wirksamkeit gegenüber DE mit SO1861. Immunhistochemische Analysen zeigten, das Tumorzellen mit verringerter Expression des Zielrezeptors, sich verstärkt der Monotherapie entziehen können, was zum weiteren Tumorwachstum führt. Bei der wirksamen Konzentration beobachteten wir keine Lebertoxizität und keine anderen Nebenwirkungen mit Ausnahme einer reversiblen Hautverhärtung an der Injektionsstelle von SO1861. Eine Zunahme der Plättchenzahl, des Plättchencharakters und der Plättchen-Verteilungsbreite wurde in der zielgerichteten Therapie mit dem Fusionsprotein beobachtet, wohingegen in der Dianthin-dPGS Zieltherapie eine Erhöhung der Alanintransaminase verzeichnet werden konnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination eines zielgerichteten Toxins mit SO1861 ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist. Würde ich auch schließen, dass dPGS-Targeting eines Transporters eine wertvolle Alternative zum klassischen Liganden-Rezeptor-Targeting ist

Bhallataka Rasayana: A Boon in Cancer Treatment

Bhallataka (Semecarpus Anacardium) is one of the Rasayana drugs mentioned in Ayurveda. Semecarpus Anacardium plant belongs to the family Anacardiaceae having allergic expressions as contact dermatitis which originates the fear about use in mind but in Ayurveda it have been used since tradition in various diseased conditions like wounds, piles, uncontrolled cell growth, abdominal lumps etc. Despite these conditions it is more likely used as Rasayana for diseased free long life. Rasayana medicines help in rejuvenating the cells and tissues with antioxidant and cyto-protective properties. In Vitro effects of Semecarpus Anacardium extracts Bhallataka has been evaluated pharmacologically on the isolated tissues and the whole animal. The therapeutic effects of the extract are due to its chemical constituents as phenols, glycosides and lipids mainly. The review supports the information on the use of Semecarpus Anacardium extracts in different cancer conditions