Measurement of fecal glucocorticoid metabolites and evaluation of udder characteristics to estimate stress after sudden dry-off in dairy cows with different milk yields

Sudden dry-off is an established management practice in the dairy industry. But milk yield has been increasing continuously during the last decades. There is no information whether the dry-off procedure, which often results in swollen and firm udders, causes stress, particularly in high-producing dairy cows. Therefore, we evaluated the effect of a sudden dry-off on extramammary udder pressure and the concentration of fecal glucocorticoid metabolites (i.e., 11,17-dioxoandrostane, 11,17-DOA) as an indirect stress parameter. Measurements were carried out within the last week before dry-off and until 9d after dry-off considering 3 groups of milk yield (i.e., low: <15 kg/d, medium: 15-20 kg/d, and high: >20 kg/d). Udder pressure increased in all yield groups after dry-off, peaked at d 2 after dry-off and decreased afterwards. Pressures were highest in high-yielding cows and lowest in low-yielding cows. But only in high-yielding cows was udder pressure after dry-off higher than before dry- off. Baseline 11,17-DOA concentrations depended on milk yield. They were highest in low-yielding (121.7 ± 33.3 ng/g) and lowest in high-yielding cows (71.1 ± 30.0 ng/g). After dry-off, 11,17-DOA increased in all yield groups and peaked at d 3. Whereas in medium- and high-yielding cows 11,17-DOA levels differed significantly from their respective baseline during the whole 9-d measuring period, low-yielding cows showed elevated 11,17-DOA levels only on d 3 after dry-off. However, especially the increase in 11,17-DOA after dry-off between the 3 yield groups was considerably different. Mean 11,17-DOA increase from baseline to d 3 was highest in high-yielding cows (129.1%) and considerably lower in low-yielding cows (40.1%). The highest fecal 11,17-DOA concentrations were measured on d 3 after dry-off, indicating that the stress was most intense on d 2, which is due to an 18-h time lag; at about the same time, udder pressure peaked. Our results showed a negligible effect of a sudden dry-off on low-yielding cows. High-yielding cows, however, faced high extramammary pressures and increased glucocorticoid production. Considering animal welfare aspects, a review of the current dry-off strategies might be warranted

Bestimmung von Stress verursacht durch das Trockenstellen bei Milchkühen und dessen Zusammenhang mit der Milchleistung und dem Euterdruck

An abrupt cessation of milking at the time of dry-off is a most common and a well-proven management procedure that was already established at the beginning of the 20th century. But whereas cows even in the 1970s rarely produced more than 9 kg milk per day at the time of dry-off, in recent years milk yield exceeding 30 kg and more is not uncommon. In addition to an increased udder firmness and udder swelling after an abrupt cessation of milking, cows frequently show certain behavioral changes, e.g., reduced feed intake and increased vocalization. These behavioral changes might be an indicator for stress, pain and discomfort. Considering these evidences, I hypothesized that there is a relationship between milk yield at the time of dry-off, udder pressure and elevated stress levels after dry-off. Thus, the overall objective of this thesis was, to evaluate stress caused by drying-off dairy cows and to relate milk yield at dry-off, udder pressure and stress levels after dry-off. While udder pressure has been measured for multiple reasons, the equipment used in previous studies was cumbersome and had diverse technical limitations. Manual palpation, however, might be subjective. A new device, a dynamometer, developed to measure fruit crisp, facilitates an objective, non-invasive measurement of udder pressure. While these dynamometers have been already validated for the measurement of fruit crisp, there is a dearth of information about their applicability to measure udder pressure. Therefore, the objective of the first study of my thesis was to validate a dynamometer (Penefel DFT 14) for the measurement of udder pressure in dairy cows. Two experiments were conducted in order to establish a measuring procedure that guarantees an excellent inter-investigator repeatability. In both experiments udder pressure was measured multiple times (n = 2838) by two independent investigators. According to operation procedures implemented for the measurement of fruit crisp, an initial protocol utilized in experiment 1 was developed. The basic handling of the device was determined, the penetration depth was roughly defined, and a general definition of the measuring location was given. Following this protocol, the agreement between investigators was mediocre and repeatability was not sufficient (i.e., r = 0.80, P < 0.001). Therefore, it was improved and experiment 2 was conducted. This protocol featured the usage of a spacer to define the penetration depth more precisely and the marking of the measuring point. In this experiment there was no disagreement between investigators (P > 0.05) and the coefficient of correlation exceeded the one calculated for experiment 1 clearly (i.e., r = 0.94, P < 0.001). Experiment 1 and 2 demonstrated that udder pressure measurements with a sufficient inter- investigator repeatability could be achieved with an exact measuring protocol. A third experiment was conducted in order to quantify the effects of location within a given quarter and between quarters on udder pressure. Therefore, udder pressure was measured in 6 different locations – at the upper, middle, lower third of the left hind quarter (n = 198) and in the middle of each quarter at the same level (n = 56). Udder pressure differed significantly between the three locations within the left hind quarter. Between quarters udder pressure was lower in the front than in the hind quarters (P < 0.05). Based on these results, it was recommended to carry out udder pressure measurements at the same quarter and at the same level in order to achieve comparable results. In the last experiment, the change of udder pressure before to after milking and its relationship to milk yield was investigated. Measurements were carried out 1 h ± 30 min before and directly after the evening milking. Udder pressure decreased after milking in 91.5% of the udders. In average, pressures after milking were 36.5% lower than before. The predictive value of udder pressure, however was limited (i.e., correlation udder pressure change – milk yield r = 0.42, P < 0.001). Nevertheless, this experiment showed the importance of measuring udder pressure every day at the same time before or after milking in order to allow an objective comparison of values. The first study provided evidence that the dynamometer provides reliable results, given that a standardized protocol is followed in order to minimize confounding. The second study determined the relationship between milk yield, udder pressure and stress levels before dry-off and in the early dry period. While the dynamometer presented an adequate method to measure udder pressure, the evaluation of stress in dairy cows was challenging. The blood cortisol concentration is a common, albeit highly sensitive indicator of stress that is not usable to determine chronic stress levels. 11,17-dioxoandrostane, a fecal cortisol metabolite is less susceptible to acute stress and provides a reliable alternative for the measurement of chronic stress. Therefore, the objectives of the second study were 1) to quantify changes of udder pressure and fecal 11,17-dioxoandrostane concentrations after a sudden dry-off, 2) to determine the effect of milk yield prior to dry-off on udder pressure and the fecal 11,17-dioxoandrostane concentration, and 3) to evaluate the relationship between udder pressure and fecal 11,17-dioxoandrostane concentration in the early dry period. Seventy-six healthy, late-lactating Holstein-Friesian dairy cows were enrolled in the study 7 days before dry-off. They were grouped based on their average daily milk yield in low ( 20 kg/d, n = 25) yielding. Udder pressure was measured daily at the same time utilizing the Penefel DFT 14. Fecal samples were collected twice within the last week before dry-off and 2, 3, 5, 7 and 9 days after dry-off. An 11-oxo- etiocholanolone enzyme immunoassay was carried out to determine the 11,17-dioxoandrostane concentration. For all cows, an effect of yield group (P = 0.001) and day (P < 0.001) on udder pressure could be proven. Udder pressure increased in all yield groups (P < 0.001) after dry-off, peaked on the second day after dry-off and declined afterwards. Considering different yield groups, udder pressure after dry-off was highest in high yielding cows. Values differed between high and low yielding and between medium and low yielding cows for 9 and 7 days after dry-off, respectively (P < 0.05). Milk leakage was recorded as one factor associated with udder pressure. While a total of 27 cows (33.8%) had milk leakage after dry-off, cows with high udder pressure were more likely to show milk leakage than cows with low pressure values (P = 0.021). After dry-off, 11,17-dioxoandrostane concentrations were effected by day (P = 0.005) and udder pressure (P = 0.05). They increased after dry-off in medium and high yielding cows, peaked on day 3 after dry-off and remained at an elevated level afterwards (P < 0.05). In low yielding cows, however, only the 11,17-dioxoandrostane concentration on the third day after dry-off was higher than the baseline (P = 0.005). While 11,17-dioxoandrostane concentrations after dry-off did not differ between yield groups (P > 0.05), the increase of 11,17-dioxoandrostane compared to the baseline diverged clearly (P < 0.05). It was highest in high yielding cows (P < 0.001). The increase in low yielding cows, however, was negligible. Interestingly, udder pressure and 11,17-dioxoandrostane concentrations after dry-off showed a similar profile, but a time lag of 1 day. Former studies evaluated a time lag of 8 to 16 h between an increase in blood cortisol coinciding with the triggering stressor and an elevated concentration of fecal 11,17-dioxoandrostane. Therefore, a causal relationship between udder pressure and 11,17-dioxoandrostane concentration could be suspected. This hypothesis is furthermore supported by the fact that high yielding cows had the highest udder pressure values and the highest increase in 11,17-dioxoandrostane. Overall, the second study showed that an abrupt cessation of milking causes an increase in udder pressure and fecal stress hormone concentration. While high yielding cows showed higher udder pressure and a greater increase in their stress levels after dry-off, the effect of a sudden dry-off on low yielding cows was negligible. The effect of a sudden dry-off on udder pressure and stress levels in high yielding cows was clearly demonstrated in the second study of this thesis, the relevance of these data for the dairy husbandry and animal welfare, however, remained unclear. In order to prove the importance of this research results, especially for German dairy farms and to substantiate the relevance of this thesis a third experiment was conducted. The objectives of this third study were 1) to evaluate current dry-off strategies on German dairy farms using a questionnaire, 2) to quantify behavior indicative of stress after dry-off, and 3) to compare dry-off strategies used on commercial dairy farms to recommendations given in the current literature. A questionnaire was developed and distributed among participants in a continuing education event organized by a German cattle breeding organization. Two hundred questionnaires were distributed and data from 91 farms (35 to 1,000 lactating cows) with an average milk yield of 8,949 kg 305-day lactation were analyzed. Farmers participating in the survey mentioned that cows were dried off approximately 7 weeks before the calculated calving date. Only 9.9% of the farms had a dry period length of 5 weeks or less. A continuous milking regime without dry period was not established on any farm participating in the survey. The majority (73.0%) of the farmers performed a sudden dry-off without any previous preparation. Only 11.8% and 15.0% of the farms attempted to lower milk yield prior to dry-off by reducing the milking frequency and adjusting the feed ration, respectively. Most farmers (94.1%) transferred cows after last milking to a separate dry cow pen. At the same time the feed ration was mostly (76.5%) changed to a low energy density roughage mix. Only 7.1% of the farmers reduced the feed quantity instead of changing the ration. A blanked antibiotic dry cow treatment was carried out on 79.6% of the farms, whereas 64.9% of all antibiotic dry cow treatments were conducted without preceding bacteriological examination. A selective dry cow treatment was not mentioned by any farmer. Milk yield was an important factor considering the dry-off management. Most farmers (77.4%) preponed the dry-off date, if milk yield fell below an individual threshold, an altered dry-off procedure in high yielding dairy cows, however, was rare (9.7%). Besides milk yield, udder health was the most important factor to adjust the dry-off procedure. Reasons to forgo the dry-off were clinical (78.9%) and subclinical mastitis (16.7%). All participating farmers monitored their dry cows, 92.1% by evaluating the general health status of the cow. Only 29.2% of the participating farmers, however, regularly touched the udder and checked for udder pain. The last section of the questionnaire covered questions about behavioral changes associated with stress after dry-off. Each farmer participating in the study reported at least one stress related behavior like reduced feed intake and increased vocalization. Regarding the overall hypothesis of my thesis, the results of the three studies demonstrated that the sudden dry-off is a stressful management procedure in high yielding dairy cows. Considering increasing milk yield, this finding is relevant as the sudden dry-off currently is one of the most common dry-off procedures. Therefore, a re- evaluation of present dry-off methods especially in high yielding cows is indicated. Strategies to reduce udder pressure and stress caused by an abrupt cessation of milking are necessary and further research is warranted in this field.Das abrupte Trockenstellen ist eine allgemein etablierte und allseits bewährte Methode, welche bereits seit Beginn des 20. Jahrhunderts Anwendung findet. Während das Tagesgemelk zum Zeitpunkt des Trockenstellens jedoch noch in den 70er Jahren selten 9 kg überstieg, sind heute Milchleistungen von 30 kg und mehr keine Seltenheit. Als Folge zeigen Kühe heute nach einem abrupten Trockenstellen nicht nur eine vermehrte Euterschwellung und gesteigerte Euterfestigkeit, sondern auch Verhaltensänderungen wie verminderte Fresslust und vermehrt Lautäußerungen. Diese Verhaltensänderungen sind als Ausdruck von Stress, Schmerz und Unbehagen bekannt. Daher lag die Vermutung nahe, dass es einen Zusammenhang zwischen hoher Milchleistung zum Zeitpunkt des Trockenstellens, hohem Euterdruck nach dem Trockenstellen und einem erhöhten Stresslevel gibt. Deshalb war es das Ziel dieser Doktorarbeit, den durch das abrupte Trockenstellen möglicherweise verursachten Stress bei Milchkühen zu quantifizieren und diesen Stress mit der Milchleistung vor dem Trockenstellen sowie dem Euterdruck nach dem Trockenstellen in Beziehung zu setzten. Zur Beantwortung dieser Fragestellung war jedoch eine objektive Methode den Euterdruck zu messen essentiell. Zwar wurde der Euterdruck bereits in der Vergangenheit im Rahmen von Studien gemessen, das benutze Equipment war jedoch unhandlich und unterlag diversen technischen Einschränkungen. Im Gegensatz dazu ist die manuelle Palpation ein eher subjektives Verfahren. Ein neues Gerät, ein sogenanntes Dynamometer, welches ursprünglich für die Bestimmung des Reifegrades von Früchten entwickelt wurde, ermöglicht objektive, nicht invasive Messungen von Festigkeiten. Während Dynamometer bereits für die Messung der Fruchtreife und -festigkeit validiert sind, fehlen jedoch Informationen zu ihrer Anwendbarkeit bei der Euterdruckmessung. Daher war es das Ziel der ersten Studie, ein Dynamometer (Penefel DFT 14) zur Messung des Euterdrucks bei Milchkühen zu validieren. Im ersten Schritt wurde dazu eine Messmethode entwickelt, die bestmögliche Wiederholbarkeit zwischen 2 Untersuchern garantiert. Hierfür wurden 2 Experimente durchgeführt. Bei beiden Experimenten wurde der Euterdruck mehrmals (n = 2838) jeweils von 2 unabhängigen Untersuchern gemessen. Das ursprüngliche Protokoll, welches im ersten Experiment zum Einsatz kam, wurde in Anlehnung an die Arbeitsanweisungen zur Messung der Fruchtreife entwickelt. Der generelle Umgang mit dem Messgerät wurde erklärt, die Eindringtiefe der Messspitze grob definiert und die Messlokalisation bestimmt. Entsprechend dieses Protokolls war die Übereinstimmung zwischen den Untersuchern eher mäßig und die Wiederholbarkeit nicht ausreichend (r = 0,80; P < 0,001). Aus diesem Grund wurde das Messprotokoll überarbeitet und das zweite Experiment unter Berücksichtigung des verbesserten Protokolls durchgeführt. Dieses umfasste das Anbringen eines Abstandshalters um die Eindringtiefe der Messspitze präziser zu definieren sowie die Kennzeichnung der Messlokalisation. Mit diesem Protokoll konnte kein Unterschied zwischen den Untersuchern festgestellt werden (P > 0,05). Der Korrelationskoeffizient überstieg den für das erste Experiment berechneten deutlich (r = 0,94; P < 0,001). Die Experimente 1 und 2 haben gezeigt, dass Euterdruck unter Berücksichtigung eines exakten Messprotokolls mit einer ausreichenden Wiederholbarkeit gemessen werden kann. Ein drittes Experiment wurde durchgeführt um den Einfluss der Messlokalisation innerhalb eines Viertels und zwischen verschiedenen Vierteln auf den Euterdruck zu bestimmen. Dazu wurde der Euterdruck in 6 verschiedenen Lokalisationen am Euter gemessen. Zum einen wurde im oberen, mittleren und unteren Drittel des linken Hinterviertels gemessen (n = 198), zum anderen in der Mitte jedes der vier Viertel jeweils auf gleicher Höhe. Im Ergebnis differierte der Euterdruck innerhalb des linken Hinterviertels deutlich (P < 0,05). Zudem zeigten sich Druckunterschiede zwischen den Vorder- und Hintervierteln (P < 0,05). Basierend auf diesen Ergebnissen sollten Euterdruckmessungen für eine optimale Wiederholbarkeit immer am selben Viertel und auf derselben Höhe durchgeführt werden. Im letzten Experiment wurde der Zusammenhang zwischen Euterdruckänderung von vor zu nach dem Melken im Vergleich zur Gemelksmenge untersucht. Die Messungen wurden jeweils 1 h ± 30 min vor sowie direkt nach dem abendlichen Melken durchgeführt. Im Ergebnis sank der Euterdruck nach dem Melken bei 91,5% der Tiere und fiel im Mittel um 36,5%. Der Vorhersagewert des Euterdrucks für die jeweilige Gemelksmenge ist jedoch begrenzt (r = 0,42; P < 0,001). Nichtsdestotrotz unterstreicht dieses Experiment die Bedeutung des Messzeitpunktes im Vergleich zur Melkzeit. Für einen objektiven Vergleich von Druckwerten sollte der Euterdruck täglich annähernd zur gleichen Zeit gemessen werden. Insgesamt zeigt die erste Studie, dass eine verlässliche Messung des Euterdrucks mittels eines Dynamometers möglich ist. Voraussetzung dafür ist jedoch die Einhaltung eines standardisierten Messprotokolls. Während für die Messung des Euterdrucks somit eine adäquate Methode zur Verfügung stand, war die Quantifizierung von Stress bei Kühen eine Herausforderung. Zwar ist die Messung der Kortisolkonzentration im Blut ein etabliertes, jedoch auch hoch sensibles Verfahren, sodass dieser Parameter für die Bestimmung chronischer Stresszustände nur bedingt geeignet ist. 11,17-Dioxoandrostan hingegen ist ein im Kot verzögert ausgeschiedener Kortisolmetabolit, der weniger empfindlich auf akute Stresszustände reagiert und daher eine zuverlässige Alternative zur Messung bei chronischen Stresszuständen bietet. Entsprechend dem Ansatz dieser Doktorarbeit einen Zusammenhang zwischen Euterdruck und Stress nach dem Trockenstellen nachzuweisen, war es das Ziel der zweiten Studie 1) Änderungen des Euterdrucks sowie der 11,17-Dioxoandrostankonzentration im Kot nach dem Trockenstellen zu quantifizieren, 2) den Einfluss der Milchleistung vor dem Trockenstellen auf den Euterdruck sowie die 11,17-Dioxoandrostankonzentration zu bestimmen und 3) den Zusammenhang zwischen Euterdruck und 11,17-Dioxoandrostan-konzentration in der frühen Trockenstehphase zu untersuchen. Sechsundsiebzig klinisch gesunde, spätlaktierende Holsteinrinder wurden jeweils 7 Tage vor ihrem geplanten Trockenstelltermin in die Studie aufgenommen und entsprechend ihrer Milchleistung in 3 Gruppen unterteilt. Die durchschnittliche Milchleistung niedrigleistender Tiere lag bei unter 15 kg/d (n = 25), mittelleistender Tiere zwischen 15 und 20 kg/d (n = 26) und hochleistender Tiere bei über 20 kg/d (n = 25). Der Euterdruck wurde täglich zur gleichen Zeit und mit Hilfe des Penefels DFT 14 gemessen. Kotproben zur Bestimmung des 11,17-Dioxoandrostan wurden zweimal direkt vor dem Trockenstellen sowie an den Tagen 2, 3, 5, 7 und 9 nach dem Trockenstellen genommen. Ein 11-Oxo-Etiocholanolone- Enzymimmunoassay wurde zur Bestimmung der 11,17-Dioxoandrostan-konzentration durchgeführt. Sowohl die Milchleistungsgruppe (P = 0,001) als auch der Tag nach dem Trockenstellen (P < 0,001) hatten einen Einfluss auf die Höhe des Euterdrucks. Dieser stieg in allen drei Gruppen direkt nach dem Trockenstellen an (P < 0,001), erreichte seinen Maximalwert am Tag 2 nach dem Trockenstellen und sank im Anschluss kontinuierlich ab. Die höchsten Druckwerte wurden bei hochleistenden Tieren nachgewiesen. So unterschieden sich hoch- und niedrigleistende Tiere bis zum 9. Tag, mittel- und niedrigleistende Tiere bis zum 7. Tag nach dem Trockenstellen (P < 0,05). Milchtröpfeln wurde als ein mit dem Euterdruck in Verbindung stehender Parameter bei 27 Tieren (33,8%) nach dem Trockenstellen festgestellt. Die Wahrscheinlichkeit für dessen Auftreten war jedoch bei hochleistenden Tieren deutlich höher als bei niedrigleistenden (P = 0,021). Nach dem Trockenstellen wurde sowohl ein Einfluss des Versuchstages (P = 0,005) als auch des Euterdrucks (P = 0,05) auf die 11,17-Dioxoandrostankonzentration nachgewiesen. Diese stieg bei hoch- wie auch mittelleistenden Tieren nach dem Trockenstellen an und erreichte einen Maximalwert an Tag 3 nach dem Trockenstellen. Im Anschluss blieben die Werte auf einem annähernd konstant hohen Level (P < 0,05). Bei niedrigleistenden Tieren überstieg die 11,17-Dioxoandrostankonzentration nur an Tag 3 nach dem Trockenstellen den Basalwert (P = 0,005). Während sich nach dem Trockenstellen die absoluten 11,17-Dioxoandrostankonzentrationen nicht zwischen den Leistungsgruppen unterschieden, zeigten sich deutliche Divergenzen bei den Kurvenanstiegen im Vergleich zu den Basalwerten (P < 0,05). Bei den mittelleistenden Tieren konnte ebenso wie bei den hochleistenden Tieren nach dem Trockenstellen ein deutlicher Anstieg verzeichnet werden (P < 0,001). Der Anstieg bei niedrigleistenden Tieren war hingegen vernachlässigbar gering. Interessanterweise zeigten Euterdruck und 11,17-Dioxoandrostankonzentration, abgesehen von einer zeitlichen Verschiebung um einen Tag, einen ähnlichen Kurvenverlauf auf. Vorhergehende Studien haben nachgewiesen, dass zwischen auslösendem Stressor und Anstieg der Konzentration von Kortisol im Blut nur wenige Sekunden, bis zum Nachweis erhöhter 11,17-Dioxoandrostankonzentrationen im Kot jedoch mindesten 8 – 16 h vergehen. Daher lag die Vermutung nahe, dass der Anstieg des Euterdrucks Auslöser für die Erhöhung der 11,17-Dioxoanstrostanwerte war. Diese Annahme wurde zudem vom Sachverhalt gestützt, dass hochleistende Tiere sowohl die höchsten Euterdruckwerte als auch den größten Anstieg an 11,17-Dioxoandrostan aufwiesen. Im Ergebnis beweist diese zweite Studie, dass der Effekt eines abrupten Trockenstellens bei niedrigleistenden Tieren zwar vernachlässigbar ist, es bei hochleistenden Tieren jedoch zu einem erheblichen Anstieg des Euterdr

A new look at the architecture and dynamics of the Hydra nerve net.

The Hydra nervous system is the paradigm of a simple nerve net. Nerve cells in Hydra, as in many cnidarian polyps, are organized in a nerve net extending throughout the body column. This nerve net is required for control of spontaneous behavior: elimination of nerve cells leads to polyps that do not move and are incapable of capturing and ingesting prey (Campbell, 1976). We have re-examined the structure of the Hydra nerve net by immunostaining fixed polyps with a novel antibody that stains all nerve cells in Hydra. Confocal imaging shows that there are two distinct nerve nets, one in the ectoderm and one in the endoderm, with the unexpected absence of nerve cells in the endoderm of the tentacles. The nerve nets in the ectoderm and endoderm do not contact each other. High-resolution TEM (transmission electron microscopy) and serial block face SEM (scanning electron microscopy) show that the nerve nets consist of bundles of parallel overlapping neurites. Results from transgenic lines show that neurite bundles include different neural circuits and hence that neurites in bundles require circuit-specific recognition. Nerve cell-specific innexins indicate that gap junctions can provide this specificity. The occurrence of bundles of neurites supports a model for continuous growth and differentiation of the nerve net by lateral addition of new nerve cells to the existing net. This model was confirmed by tracking newly differentiated nerve cells