Diffusion of toxins into Medaka embryos

Puromycin findet mehrere Anwendungsmöglichkeiten in den Methoden der heutigen Zellkultur. Aufgrund seiner Translations-inhibierenden Wirkung wird es vor allem als Selektionsmarker für Transfektion und ebenso zur Selektion von transgenen gram+ Bakterien und verschiedenen transgenen Zelllinien von Tieren und Insekten eingesetzt. Neben diesen in vitro Methoden ist keine Benutzung von Puromycin in vivo bekannt. Im ersten Teil meiner Diplomarbeit wurde versucht, eine Methode zu entwickeln, welche Puromycin als Selektionsmarker für transgene Fische in vivo ermöglicht. Als Modellorganismus wurde Medaka (Oryzias latipes), ein kleiner Fisch welcher der Familie der Reisfische angehört, verwendet. Neben dem geläufigen Zebrafisch (Danio rerio), ist Medaka wohl der am häufigsten verwendete Fisch-Modellorganismus. Über DNA-Mikroinjektion würde neben dem DNA-Konstrukt, welches für das jeweilige Experiment gerade verwendet wird, auch das Puromycin-Resistenzgen pac in das Zytoplasma eines sich im Einzellstadiums befindlichen Medaka Embryos eingebracht werden. Die nachfolgende Selektion durch eine bestimmte Puromycinkonzentration im Medium würden nur transgene Embryonen, welche das Resistenzgen besitzen, überleben. Doch schon die Resultate der Experimente, welche die richtige Konzentration an Puromycin im Medium bestimmen sollten, zeigten dass Puromyzin als Selektionsmarker in vivo höchstwahrscheinlich nicht geeignet ist. Die Resultate stellten uns vor die Frage nach dem generellen Prozess der passiven Diffusion von kleinen, toxischen Substanzen in die Zellen des Fischembryos. Zusätzlich wurde die Rolle des stark ausgebildeten Chorions von Medakas betreffend der Funktion während der Diffusion untersucht. Diffusionsexperimente mit Ethanol oder Natriumazid unter normalen Bedingungen zeigten deutliche Unterschiede in den Diffusionsraten während der Embryonalentwicklung. Der Vergleich mit der Behandlung unter veränderten Bedingungen, wie durch die Dechorionisierung der Embryos mit Hatching Enzym oder die gleichzeitige Behandlung mit dem Detergent Triton X-100, konnten das Chorion als Ursache für die Modulierung der Diffusionsrate ausmachen. Das Chorion spielt also eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Toxizität von Chemikalien während der Embryonalentwicklung.The antibiotic puromycin has several common used applications in cell culture experiments. Because of its translation-inhibiting effect, it is used as a selection marker for transfection, for the selection of transgenic gram+ bacteria and the selection of various transgenic cell lines in different animals and insects. Beside of its use in these applications in vitro, no known in use of puromycin in vivo is known. In the first part of my diploma thesis I tried to find parameters for a method, which would allow puromycin as a selection marker in vivo, as selection marker for transgenic medaka fish embryos. Medaka (Oryzias latipes) is next to the known zebrafish (Danio rerio) the most used model organism in fish. Constructed plasmids, containing the gene of interest and the puromycin resistance gene pac, would be injected into the cytoplasm of a one- or two-cell-stage medaka fish embryo. The addition of a certain concentration of puromycin, which would have to be determined, into the embryo rearing medium (ERM) would only allow the transgenic embryos to survive. However, the experiments for the determination of the right concentration of puromycin in ERM already indicated, that puromycin seemed to be inappropriate as a selection marker in vivo. The results of these first experiments with puromycin questioned the general process of passive diffusion of small toxic substances into the cells of medaka fish embryos. Especially the role of the strong medaka chorion in this process was of interest. Experiments with ethanol and sodium azide showed significant differences of diffusion, and therefore death rates during the embryonic development of medaka. The comparison with results after treatment with ethanol or sodium azide under modified conditions, like the dechorionization of embryos with hatching enzyme or additional treatment with the detergent Triton X-100, strengthen our observations that indeed the chorion modulates the diffusion rates into the embryos. Therefore, the chorion plays an important role in the determination of toxicity of chemicals during the embryonic development

Analysis of the type-I ELM duration regulation at ASDEX Upgrade

Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüftAbweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersDie H-Mode stellt einen Zustand magnetisch eingeschlossener Fusionsplasmen in Tokamaks dar und zeichnet sich durch eine Randtransportbarriere aus. Diese entspricht einem Bereich steiler Dichte- und Temperaturgradienten an einer Position innerhalb der Separatrix. Am Rand von Plasmen in der H-Mode treten quasiperiodische magneto- hydrodynamische Instabilitäten auf. Diese sogenannten ELMs führen zu Teilchen- und Energieverlusten des Plasmas, wobei die größten Verluste bei Typ-I ELMs auftreten. Die Dauer von Typ-I ELMs kann auch innerhalb derselben Plasmaentladung variieren. Dies gibt Anlass zu folgender Hypothese, welche in der vorliegenden Arbeit untersucht wird: Während eines ELMs bricht das radiale elektrische Feld Er ein, sodass dessen Betrag weniger als 15 kV/m ausmacht. Solche Werte sind typisch für die L-Mode. Folglich bricht die Randtransportbarriere, welche von der Scherung des radialen elektrischen Feldes aufrecht gehalten wird ebenso zusammen und der hohe Druck im Plasmainneren verursacht starken nach außen gerichteten Transport. Nur wenn Er einen Grenzwert überschreitet, kann die Randtransportbarriere wieder errichtet werden, sodass der starke Transport stoppt. Nimmt man dominanten neoklassischen Ionentransport an, so wird das radiale elektrische Feld durch das Verhältnis vom Ionendruckgradienten und der Dichte am Plasmarand bestimmt. Folglich reguliert der Elektronen-Ionen-Wärmeaustausch indirekt durch seinen Einfluss auf den Ionentemperaturgradienten das radiale elektrische Feld und damit auch die ELM-Längen.Im Rahmen dieser Arbeiten werden 36 Zeitintervalle aus 20 verschiedenen ASDEX Upgrade Entladungen analysiert, wobei für den Großteil hochaufgelöste Ladungsaustausch- Rekombinations- Spektroskopie- Messungen vorhanden sind. Um verschiedene Plasmagrößen am Pedestalanfang und an einer Position innerhalb der Separatrix vor und nach einerseits kurzen und andererseits langen Typ-I ELMs zu vergleichen, wird ein Algorithmus entwickelt, welcher zur Bestimmung der ELM-Start- und -Endzeiten das Diverstrom- mit dem Pick-up-Spulen-Signal kombiniert. Dieser Algorithmus wird als Submodul der Analyseumgebung FusionFit implementiert.Es werden keine Zusammenhänge zwischen dem stoßbedingten Elektronen-Ionen-Wärmefluss oder der neoklassischen Approximation vom radialen elektrischen Feld und den ELM-Längen gefunden. Außerdem wird das Verhältnis vom gesamten stoßbedingten Elektronen-Ionen-Wärmefluss und dem gesamten Ionenwärmefluss für eine Beispielentladung als 0.0046 bestimmt, was darauf hindeutet, dass der gesamte stoßbedingte Elektronen-Ionen-Wärmefluss im Vergleich zum gesamten Ionenwärmefluss vernachlässig-bar ist. Ferner fällt der Betrag des Minimums des Profils des radialen elektrischen Feldes während langer ELMs nur in 10 von 20 Fällen mit entsprechender zur Verfügung ste- hender Datenlage auf einen Wert unterhalb von 15 kV/m. Die Hypothese wird daher widerlegt. Allerdings wird ein Zusammenhang mit den ELM-Längen und sowohl dem post-ELM Minimum des radialen elektrischen Feldes, als auch dem post-ELM Turbulenzenkontrollparameter αt an einer Position innerhalb der Separatrix gefunden. Außerdem wird eine Korrelation zwischen αt innerhalb der Separatrix bezogen auf Zeitintervalle nach kurzen ELMs und den Minima von Er bezogen auf Zeitintervalle nach kurzen ELMs festgestellt. Folglich scheint ein Wechselspiel des radialen elektrischen Feldes und der Randturbulenzen beziehungsweise des -transports die ELM-Längen zu regulieren.H-mode represents an operational mode of magnetically confined plasmas in a tokamak with enhanced confinement due to the edge transport barrier (ETB), a region of steep density and temperature gradients at a position inside the separatrix. At the edge of H-mode plasmas repetitive magnetohydrodynamic instabilities called edge localised modes (ELMs) occur. It has been shown that type-I ELMs, which cause large energy losses, vary with respect to their duration even within the same discharge. Therefore the following hypothesis is evaluated: During an ELM the absolute value of the radial electric field Er collapses to values below 15 kV/m, which are typical for L-mode. As a consequence the ETB sustained by the radial electric field shear breaks down and strong filamentary transport is driven by the high pressure in the core. Only if Er exceeds a critical value, the edge transport barrier builds up again and the strong transport stops. Assuming dominant neoclassical ion transport the radial electric field is set by the ratio of the edge ion pressure gradient and the density. Therefore the collisional electron-ion- heat-exchange qei at the separatrix sets the radial electric field indirectly through the ion temperature gradient and therefore regulates the ELM duration.In this thesis 36 temporal intervals provided by 20 ASDEX Upgrade discharges are analysed, whereby for the majority of them highly resolved charge exchange recombination spectroscopy measurements are available. In order to compare various quantities at the pedestal top and the pedestal foot before and after both long and short type-I ELMs, an algorithm is developed combining the divertor current and the magnetic pick- up current signals to determine the ELM-onset and -ending times. This algorithm is implemented as a module in the application development system FusionFit.No correlation between the collisional electron-ion-heat-exchange or the neoclassical pre- diction of the radial electric field and the ELM duration can be identified. Furthermore the ratio of the total collisional electron-ion-heat-exchange and the total ion heat flux is estimated for an exemplary discharge to be about 0.0046. This means that the total collisional electron-ion-heat-exchange can be neglected in comparison to the total ion heat flux. It is shown that only for 10 out of 20 temporal intervals with available data, during the sufficiently long ELMs the absolute value of the minimum of the radial electric field lies below the limit of 15 kV/m, which is typical for L-mode. According to these findings the hypothesis is refuted. However, for both the post-ELM minimum of the radial electric field and the post-ELM pedestal foot turbulence control parameter a relation with the ELM duration is found. Furthermore a correlation between the post- short ELM turbulence control parameter at the pedestal foot and the absolute value of the minimum of the radial electric field is identified. Therefore an interplay between the radial electric field and the edge turbulence or rather transport tends to regulate the respective ELM durations.6

Insights into the molecular evolution of oxytocin receptor ligand binding

The design and development of selective ligands for the human OT (oxytocin) and AVP (arginine vasopressin) receptors is a big challenge since the different receptor subtypes and their native peptide ligands display great similarity. Detailed understanding of the mechanism of OT's interaction with its receptor is important and may assist in the ligand- or structure-based design of selective and potent ligands. In the present article, we compared 69 OT- and OT-like receptor sequences with regards to their molecular evolution and diversity, utilized an in silico approach to map the common ligand interaction sites of recently published G-protein-coupled receptor structures to a model of the human OTR (OT receptor) and compared these interacting residues within a selection of different OTR sequences. Our analysis suggests the existence of a binding site for OT peptides within the common transmembrane core region of the receptor, but it appears extremely difficult to identify receptor or ligand residues that could explain the selectivity of OT to its receptors. We remain confident that the presented evolutionary overview and modelling approach will aid interpretation of forthcoming OTR crystal structures

Recruitment of a cytoplasmic chaperone relay by the A(2A) adenosine receptor

The adenosine A(2A) receptor is a prototypical rhodopsin-like G protein-coupled receptor but has several unique structural features, in particular a long C terminus (of >120 residues) devoid of a palmitoylation site. It is known to interact with several accessory proteins other than those canonically involved in signaling. However, it is evident that many more proteins must interact with the A(2A) receptor, if the trafficking trajectory of the receptor is taken into account from its site of synthesis in the endoplasmic reticulum (ER) to its disposal by the lysosome. Affinity-tagged versions of the A(2A) receptor were expressed in HEK293 cells to identify interacting partners residing in the ER by a proteomics approach based on tandem affinity purification. The receptor-protein complexes were purified in quantities sufficient for analysis by mass spectrometry. We identified molecular chaperones (heat-shock proteins HSP90 and HSP70-1A) that interact with and retain partially folded A(2A) receptor prior to ER exit. Complex formation between the A(2A) receptor and HSP90 (but not HSP90) and HSP70-1A was confirmed by co-affinity precipitation. HSP90 inhibitors also enhanced surface expression of the receptor in PC12 cells, which endogenously express the A(2A) receptor. Finally, proteins of the HSP relay machinery (e.g. HOP/HSC70-HSP90 organizing protein and P23/HSP90 co-chaperone) were recovered in complexes with the A(2A) receptor. These observations are consistent with the proposed chaperone/coat protein complex II exchange model. This posits that cytosolic HSP proteins are sequentially recruited to folding intermediates of the A(2A) receptor. Release of HSP90 is required prior to recruitment of coat protein complex II components. This prevents premature ER export of partially folded receptors