Exploración de los mecanismos de adaptación y resistencia a radiación UV en microorganismos halófilos extremos

El objetivo del estudio de esta tesis doctoral fue la exploración de los mecanismos de resistencia y adaptación a radiación ultravioleta B (UVB) en microorganismos halófilos extremos. Por una parte, para aislar genes implicados en resistencia a radiación de estos microorganismos empleamos una técnica independiente de cultivo, la metagenómica funcional. Para ello, se construyeron dos bibliotecas metagenómicas, empleando a Escherichia coli como huésped, con ADN (metagenoma) extraído de salmueras de dos estanques cristalizadores de las salinas “Bras del Port” (Santa Pola, Alicante), denominados CR30 y CCAB (39% y 30% de sal respectivamente). Mediante el cribado funcional de las bibliotecas metagenómicas se aislaron ocho clones resistentes a radiación UVB. En los ocho fragmentos de ADN ambiental recuperados se identificaron quince genes de bacterias y arqueas responsables del fenotipo de resistencia a radiación UVB. Estos genes codifican para proteínas anteriormente identificadas en la resistencia al daño en el ADN, otras con función conocida pero no relacionadas con resistencia a radiación y varias proteínas con función desconocida, similares a familias de proteínas hipotéticas. Muchos de los genes también presentaron resistencia a 4-NQO, un compuesto que imita el daño en el ADN que produce la radiación UVB, por lo que esos genes podrían estar relacionados con protección o reparación del ADN; además, algunos de ellos también presentaron resistencia al compuesto tóxico perclorato. Por otra parte, para comprender como responde y se adapta la maquinaria celular de halófilos extremos a la radiación UVB, se realizó un estudio transcriptómico de la bacteria Salinibacter ruber y la arquea Haloquadratum walsbyi, para analizar los cambios de expresión génica después ser expuestos a una dosis subletal de radiación UVB y recuperarse en presencia de luz u oscuridad para Sal. ruber y sólo de luz para Hqr. walsbyi. En ambos microorganismos se observó la expresión diferencial de un porcentaje inferior al 20% de los genes. Tanto en Sal. ruber como en Hqr. walsbyi se reprimen genes implicados en la replicación del ADN y la división celular, y forma coherente, también en la transcripción, la traducción de proteínas y las rutas metabólicas que proporcionan energía y las moléculas necesarias para el crecimiento y la división celular (con algunas diferencias en Sal. ruber recuperado en luz, en el que se induce la ruta del glioxilato y la gluconeogénesis). La represión de la replicación permitiría la reparación de las lesiones en el ADN producidas por la radiación UVB, evitando la división de células con mutaciones. En ambos microorganismos se inducen genes relacionados con: i) la reparación y protección del ADN (exonucleasas, endonucleasas, Dps); ii) la protección, reparación del daño oxidativo y degradación de proteínas (chaperonas, tiorredoxinas, glutarredoxinas y proteasas); y iii) antioxidantes (superóxido dismutasa, glutatión) para eliminar especies reactivas del oxígeno generadas por la radiación UVB. Por otra parte, posiblemente para facilitar el alejamiento de las células de la radiación, se reprimen los genes implicados en la formación de vesículas de gas en Hqr. walsbyi, que les permiten flotar en el medio, y se inducen los genes de motilidad de Sal. ruber

Novel Genes Involved in Resistance to Both Ultraviolet Radiation and Perchlorate From the Metagenomes of Hypersaline Environments

Microorganisms that thrive in hypersaline environments on the surface of our planet are exposed to the harmful effects of ultraviolet radiation. Therefore, for their protection, they have sunscreen pigments and highly efficient DNA repair and protection systems. The present study aimed to identify new genes involved in UV radiation resistance from these microorganisms, many of which cannot be cultured in the laboratory. Thus, a functional metagenomic approach was used and for this, small-insert libraries were constructed with DNA isolated from microorganisms of high-altitude Andean hypersaline lakes in Argentina (Diamante and Ojo Seco lakes, 4,589 and 3,200 m, respectively) and from the Es Trenc solar saltern in Spain. The libraries were hosted in a UV radiation-sensitive strain of Escherichia coli (recA mutant) and they were exposed to UVB. The resistant colonies were analyzed and as a result, four clones were identified with environmental DNA fragments containing five genes that conferred resistance to UV radiation in E. coli. One gene encoded a RecA-like protein, complementing the mutation in recA that makes the E. coli host strain more sensitive to UV radiation. Two other genes from the same DNA fragment encoded a TATA-box binding protein and an unknown protein, both responsible for UV resistance. Interestingly, two other genes from different and remote environments, the Ojo Seco Andean lake and the Es Trenc saltern, encoded two hypothetical proteins that can be considered homologous based on their significant amino acid similarity (49%). All of these genes also conferred resistance to 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO), a compound that mimics the effect of UV radiation on DNA, and also to perchlorate, a powerful oxidant that can induce DNA damage. Furthermore, the hypothetical protein from the Es Trenc salterns was localized as discrete foci possibly associated with damaged sites in the DNA in cells treated with 4-NQO, so it could be involved in the repair of damaged DNA. In summary, novel genes involved in resistance to UV radiation, 4-NQO and perchlorate have been identified in this work and two of them encoding hypothetical proteins that could be involved in DNA damage repair activities not previously described.Fil: Lamprecht Grandío, María. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas. Centro de Astrobiologia.; EspañaFil: Cortesão, Marta. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas. Centro de Astrobiologia.; EspañaFil: Mirete, Salvador. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas. Centro de Astrobiologia.; EspañaFil: Benguigui de la Cámara, Macarena. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas. Centro de Astrobiologia.; EspañaFil: de Figueras, Carolina G.. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas. Centro de Astrobiologia.; EspañaFil: Pérez Pantoja, Danilo. Universidad Tecnológica Metropolitana; EspañaFil: White, Joseph John. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas. Centro de Astrobiologia.; EspañaFil: Farias, Maria Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Rosselló Móra, Ramon. Instituto Mediterráneo Estudios Avanzados; EspañaFil: González Pastor, José Eduardo. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas. Centro de Astrobiologia.; Españ