Cell differentiation and gene methylation in hematological malignancies

Background: Cell differentiation represents a normaldevelopmental process of all living beings. When a cell acquires its identity it is very improbable that its fate could be reversed even if the cell is situated in another environment. Cell differentiation necessitates no changes in the sequence of DNA and it seems that is under epigenetic control. In order to achieve normal cell differentiation it is necessary that some genes are silenced and not expressed in a cell-specific manner. The epigenetic mechanism that has been best studied is DNA methylation which is associated with gene transcriptional silencing and occurs in cytosines that procceed guanines in genome sequence. The reaction is catalyzed by DNA methyltransferases which attack a methylgroup in the C5 position in the cytosine ring structure. Epigenetic changes represent the first step of cell differentiation. Although epigenetic control establish early during development and cell differentiation, continuous readjustment occurs during cell cycle as response to internal and external stimuli resulting in oncogenesis. Aim: Aim of the study is to observe the methylation pattern of the MEG3 and SNRPN imprinted genes in patients with acute myeloid leukemia (AML), myelodysplastic syndromes (MDS), and multiple myeloma MM). Moreover, aberrant methylation is correlated with overall survival, disease stage, disease subtypes, cytogenetic abnormalities, and blood counts. Patients and Methods: Bone marrow genomic DNA of 85 newly diagnosed and previously untreated patients with AML (42 patients-49.4%) and MDS (43 patients-50.6%) who presented at the Department of Haematology of the University Hospital of Ioannina were evaluated. There were 57 males (67.1%), and 28 female patients (32.9%) with a mean age 71.8±13.3 years (range 16-92). All individuals were classified according to the WHO classification, and patients with MDS were re-valuated in order to fulfil the diagnostic criteria recently published. The recently proposed WHO classification-based prognostic scoring system for MDS (WPSS) was used for risk stratification of MDS patients. Bone marrow samples were also obtained, from 21 MM patients. Diagnosis of MM was based on previously published criteria. There were 21 patients (11 males-10 females) with median age 66.5 years (range 48-85 years). The MM subtypes were as following: IgG 17 patients (80.96%), IgA 3 patients (14.28%), IgM 1 patient (4.76%). DNA was extracted from bone marrow nucleated cells collected in EDTA containing tubes, and bisulphite treatment was performed using the QIAmp® DNA Mini Kit, (Qiagen), and EZ DNA methylation kit (Zymo Research) respectively according to manufacturers’ instructions. The methylation status of both genes was determined by using conventional methylation specific PCR (MSP). For MSP reaction we used the HotStarTaq Master Mix kit of Qiagen. Results: The normal pattern of MEG3 consists of 2 bands (alleles), namely one corresponding to the methylated paternal allele, (size 160 bp) and one corresponding to the unmethylated maternal allele (size 120 bp). In abnormal methylated samples only the methylated (paternal) allele (160bp) can be observed, while the unmethylated (maternal) allele (120 bp) is not generated. Abnormal methylation pattern of the MEG3 DMR was observed in 35 out of 85 patients (41.2%) evaluated with myeloid malignancies (i.e. MDS and AML patients). In particular, the aberrant methylation was observed in 15 MDS patients (34.9 %) and in 20 individuals (47.6%) with AML. Patients with RAEB-I were 20 fold more likely to present the MEG3 gene abnormally methylated (OR=20, p=0.027). The normal pattern of SNRPN consists of 2 bands, one corresponding to the methylated maternal allele, (size 174 bp) and a further band corresponding to the unmethylated paternal allele (size 100 bp). In the case of DMR aberrant methylation only the methylated (maternal) allele is observed, while the unmethylated (paternal) allele is not. Abnormal methylation was found in 36 patients (42.4%) of the 85 studied. With regard to MDS patients, 15 patients (34.9%) presented only the maternal allele, and twenty one AML individuals (50%) had SNRPN CpG methylation. MEG3’s DMR CpG methylation was associated with significant reduced OS in AML patients (HR=1.98, p=0.047), while SNRPN was not associated with OS (HR=0.94, p=0.87). In MDS, there was a trend in patients with abnormal MEG3 methylation for reduced overall survival (HR=2.15, p=0.072). ...............................................................................................................Εισαγωγή: Η κυτταρική διαφοροποίηση αποτελεί ένα φυσικό φαινόμενο το οποίο παρατηρείται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Όταν ένα κύτταρο αποκτήσει ταυτότητα μέσω της διαφοροποίησης είναι απίθανο να αλλάξει η «μοίρα» του έστω και αν το κύτταρο αυτό τοποθετηθεί σε διαφορετικό κυτταρικό περιβάλλον. Η διαδικασία της κυτταρικής διαφοροποίησης απαιτεί μη μεταβολές στη αλληλουχία του DNA και φαίνεται ότι υπόκειται σε επιγενετικό έλεγχο ο οποίος αποτελεί μέγιστο ρυθμιστικό μηχανισμό της κυτταρικής διαφοροποίησης και της μετάδοσης αυτής από το μητρικό στο θυγατρικό κύτταρο. Για την επίτευξη της κυτταρικής διαφοροποίησης απαιτείται σίγαση της έκφρασης ορισμένων γονιδίων ειδικών για ειδικό τύπο κυττάρων, μέσω της μεθυλίωσης των CpG νησίδων, και ενεργοποίηση ορισμένων άλλων. Ο καλύτερα μελετημένος επιγενετικός μηχανισμός είναι η μεθυλίωση του DNA η οποία σχετίζεται με την μεταγραφική αποσιώπηση των γονιδίων και λαμβάνει χώρα στη βάση κυτοσίνη η οποία προηγείται της βάσης γουανίνης στην ακολουθία του γονιδιώματος και η αντίδραση καταλύεται από τις μεθυλτρανφεράσες οι οποίες προσκολλούν ισοσθενώς μία μεθυλομάδα στη θέση C5 του δακτυλίου της κυτοσίνης. Το εναρκτήριο λάκτισμα για την έναρξη και διατήρηση της διαδικασίας της κυτταρικής διαφοροποίησης δίδεται από τους επιγενετικούς μηχανισμούς. Παρόλο που αυτοί οι επιγενετικοί μηχανισμοί εδραιώνονται πρώιμα κατά την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των οργανισμών, συμβαίνουν συνεχείς προσαρμογές κατά τη διάρκεια της ζωής των κυττάρων ως απάντηση σε εσωτερικά και περιβαλλοντικά ερεθίσματα που μπορεί να οδηγήσουν, αργότερα στη ζωή, στην ανάπτυξη νοσημάτων και καρκίνου. Η κυτταρική διαφοροποίηση βασίζεται στις επιγενετικές αλλαγές οι οποίες σχετίζονται με την επιλεκτική χρονικά ενεργοποίηση συγκεκριμένων γονιδίων και την ελεγχόμενη αποσιώπηση πολυδύναμων γονιδίων. Σκοπός: Να μελετηθεί το μοτίβο της μεθυλίωσης των υποκινητών των αποτυπομένων γονιδίων MEG3 και SNRPN σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ), μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) και πολλαπλό μυέλωμα (ΠΜ) και να συσχετισθούν οι τυχών διαταραχές της μεθυλίωσης με την συνολική επιβίωση των ασθενών, το στάδιο της νόσου, τους υπότυπους της νόσου, τις διάφορες χρωμοσωμιακές ανωμαλίες και τις αιματολογικές παραμέτρους. Ασθενείς και μέθοδοι: Μελετήθηκαν 85 ασθενείς με μυελοειδείς κακοήθειες (42 ασθενείς με ΟΜΛ και 43 ασθενείς με ΜΔΣ) καθώς και 21 ασθενείς με ΠΜ οι οποίοι διαγνώσθηκαν και αντιμετωπίσθηκαν στην Αιματολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. Από τους ασθενείς με μυελοειδείς κακοήθειες οι 57 (67,1%) ήταν άνδρες και οι 28 (32,9%) ήταν γυναίκες με συνολική μέση ηλικία 71,8±13,3 έτη (εύρος 16-92 έτη). Από τους 21 ασθενείς με ΠΜ οι 11 (52,4%) ήταν άνδρες ενώ οι 10 (47,6%) ήταν γυναίκες και η συνολική μέση ηλικία ήταν 66,5 έτη (εύρος 48-85 έτη). Η διάγνωση της νόσου του ΠΜ έγινε βάσει προκαθορισμένων κριτηρίων τα οποία διατυπώθηκαν από την Διεθνή Ομάδα Εργασίας του Πολλαπλού Μυελώματος. Οι ασθενείς με ΟΜΛ και ΜΔΣ ταξινομήθηκαν σύμφωνα με την ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας-ΠΟΥ και επιπλέον οι ασθενείς με ΜΔΣ επανεξετάσθηκαν ώστε να πληρούν τα πλέον πρόσφατα διαγνωστικά κριτήρια όπως αυτά διατυπώθηκαν στην συνάντηση της Διεθνούς Ομάδας ΜΔΣ το 2007. Πραγματοποιήθηκε απομόνωση γονιδιωματικού DNA από δείγματα μυελού των οστών χρησιμοποιώντας το QIAmp® DNA Mini Kit (Qiagen, Bioanalytica, Athens, Greece) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συνεχεία, το DNA σε χημική κατεργασία με διθειώδες νάτριο με τη χρήση του EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, CA, USA) βάσει του πρωτοκόλλου του κατασκευαστή. Η μελέτη της μεθυλίωσης των δύο γονιδίων έγινε με τη μέθοδο MSP, χρησιμοποιώντας το HotStar Taq Master Mix kit της Qiagen. Αποτελέσματα: Στο φυσιολογικό μοτίβο μεθυλίωσης του γονιδίου MEG3 παρατηρούνται 2 μπάντες, εκ των οποίων μία αντιστοιχεί στο μεθυλιωμένο πατρικό αλλήλιο και έχει προϊόν 160 bp και μία αντιστοιχεί στο μη-μεθυλιωμένο μητρικό αλλήλιο με προϊόν 160 bp. Στην περίπτωση της μη-φυσιολογικής μεθυλίωσης παρατηρείται η ύπαρξη μόνο του πατρικού αλληλίου ενώ δεν παρατηρείται το μητρικό αλλήλιο. .......................................................

Luspatercept: A New Tool for the Treatment of Anemia Related to β-Thalassemia, Myelodysplastic Syndromes and Primary Myelofibrosis

Anemia is a common feature of both benign and malignant hematologic diseases. Beta-thalassemia (β-thalassemia) syndromes are a group of hereditary disorders characterized by ineffective erythropoiesis, due to a genetic deficiency in the synthesis of the beta chains of hemoglobin, often accompanied by severe anemia and the need for red blood cell (RBC) transfusions. Myelodysplastic syndromes (MDS) are characterized by cytopenia(s) and ineffective hematopoiesis, despite a hypercellular bone marrow. Primary myelofibrosis (PMF) is a clonal myeloproliferative neoplasm characterized by reactive fibrosis of the bone marrow, accompanied by extramedullary hematopoiesis. Luspatercept, previously known as ACE-536, is a fusion protein that combines a modified activin receptor IIB (ActRIIB), a member of the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily, with the Fc domain of human immunoglobulin G (IgG1). It has shown efficacy in the treatment of anemia due to beta β-thalassemia, MDS and PMF and recently gained approval by the Federal Drug Agency (FDA) and the European Medicines Agency (EMA) for transfusion-dependent (TD) patients with β-thalassemia and very low to intermediate-risk patients with MDS with ringed sideroblasts who have failed to respond to, or are ineligible for, an erythropoiesis-stimulating agent. In this review, we describe the key pathways involved in normal hematopoiesis and the possible mechanism of action of luspatercept, present its development and data from the most recent clinical trials in β-thalassemia, MDS and PMF, and discuss its potential use in the treatment of these hematological disorders