Brought to light: the Bcl-2 transmembrane domain interactome elucidated by a bimolecular split luciferase assay and its impact on apoptosis signalling

Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltods, die häufig bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs gestört ist. Ein Schlüsselereignis der Apoptose ist die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran (MOMP), die von der B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) Proteinfamilie gesteuert wird. Bcl-2-Proteine bilden ein komplexes Interaktionsnetzwerk, in dem sich pro- und anti-apoptotische Mitglieder gegenseitig zugunsten von Zelltod oder -Überleben hemmen. Das Netzwerk wird durch die Interaktion zwischen dem Bcl-2 Homologie 3 Motiv (BH3) und der hydrophoben Furche definiert. Eine neue Art von niedermolekularen Wirkstoffen, sogenannte BH3-Mimeticka, welche die hydrophobe Furche anti-apoptotischer Bcl-2 Proteine besetzen, ist wirksam in der Krebstherapie. Es verdichten sich jedoch Hinweise darauf, dass die weit weniger untersuchte C-terminale Transmembrandomäne (TMD) von Bcl-2 Proteinen, die traditionell als Membrananker fungiert, ebenfalls als Interaktionsfläche dienen kann. Zur weiteren Aufklärung der Interaktionen in der Bcl-2-Proteinfamilie über die TMD wurde ein zellbasierter Assay entwickelt und validiert, bei dem das mit TMDSequenzen fusionierte bimolekulare Luziferase-System NanoBiT mit gleichzeitiger Expression von Fluorophoren zur Signalnormalisierung kombiniert wird. Eine systematische Analyse der TMD-Interaktionen zwischen pro-apoptotischen Effektor-Bcl-2-Proteinen (BAX, BAK und BOK) und anti-apoptotischen Bcl-2-ähnlichen Proteinen (BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL-1 und A1) offenbarte homotypische Interaktionen zwischen Effektor-TMDs und Interaktionen von Effektor-TMDs mit BCL-XL-TMD und BCL-W-TMD. Interessanterweise wurde eine bisher unbekannte Interaktion von BOK-TMD und BCL-2-TMD identifiziert. Die subzelluläre Lokalisierung Fluorophor-konjugierter TMD-Peptide verdeutlichte, dass einige TMDs präferentiell in Mitochondrien (BAX, BAK, BCL-XL, BCL-W) lokalisiert sind, während andere (BOK, BCL-2, MCL-1) vorwiegend mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) kolokalisiert sind. TMD-Austausch und Mutation in BAX bestätigten eine wichtige Rolle der BAX-TMD bei der BAX-Inhibition, während der TMD-Austausch in BAK einen vernachlässigbaren Einfluss auf die BAK-Regulierung durch BCL-2 hatte. Darüber hinaus hingen sowohl die Kolokalisierung von BOK und BCL-2 als auch die Hemmung des durch BOK-Überexpression induzierten Zelltods durch BCL-2 von den TMD Sequenzen ab. Dementsprechend modulierte TMD-Mutation von BCL-2 die Interaktion mit BOK-TMD, die subzelluläre Lokalisierung und die anti-apoptotische Kapazität von BCL-2. Letztlich steigerte die Abwesenheit von BCL-2 den BOK-abhängigen ER-Stress-induzierten Zelltod, was auf einen physiologischen Kontext für die funktionelle Bedeutung ihrer TMD-Interaktion hinweist. Somit hebt diese Arbeit hervor, dass die Aufklärung des Bcl-2-TMD-Interaktoms für unser Verständnis der Apoptose-Regulation wichtig ist und ebnet den Weg für zukünftige Untersuchungen der TMD als Ziel für klinische Interventionen

Efficient and crucial quality control of HAP1 cell ploidy status

The near-haploid human cell line HAP1 recently became a popular subject for CRISPR/Cas9 editing, since only one allele requires modification. Through the gene-editing service at Horizon Discovery, there are at present more than 7500 edited cell lines available and the number continuously increases. The haploid nature of HAP1 is unstable as cultures become diploid with time. Here, we demonstrated some fundamental differences between haploid and diploid HAP1 cells, hence underlining the need for taking control over ploidy status in HAP1 cultures prior to phenotyping. Consequently, we optimized a procedure to determine the ploidy of HAP1 by flow cytometry in order to obtain diploid cultures and avoid ploidy status as an interfering variable in experiments. Furthermore, in order to facilitate this quality control, we validated a size-based cell sorting procedure to obtain the diploid culture more rapidly. Hence, we provide here two streamlined protocols for quality controlling the ploidy of HAP1 cells and document their validity and necessity.publishedVersio

Stress-induced TRAILR2 expression overcomes TRAIL resistance in cancer cell spheroids

The influence of 3D microenvironments on apoptosis susceptibility remains poorly understood. Here, we studied the susceptibility of cancer cell spheroids, grown to the size of micrometastases, to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Interestingly, pronounced, spatially coordinated response heterogeneities manifest within spheroidal microenvironments: In spheroids grown from genetically identical cells, TRAIL-resistant subpopulations enclose, and protect TRAIL-hypersensitive cells, thereby increasing overall treatment resistance. TRAIL-resistant layers form at the interface of proliferating and quiescent cells and lack both TRAILR1 and TRAILR2 protein expression. In contrast, oxygen, and nutrient deprivation promote high amounts of TRAILR2 expression in TRAIL-hypersensitive cells in inner spheroid layers. COX-II inhibitor celecoxib further enhanced TRAILR2 expression in spheroids, likely resulting from increased ER stress, and thereby re-sensitized TRAIL-resistant cell layers to treatment. Our analyses explain how TRAIL response heterogeneities manifest within well-defined multicellular environments, and how spatial barriers of TRAIL resistance can be minimized and eliminated

Stress-induced TRAILR2 expression overcomes TRAIL resistance in cancer cell spheroids

The influence of 3D microenvironments on apoptosis susceptibility remains poorly understood. Here, we studied the susceptibility of cancer cell spheroids, grown to the size of micrometastases, to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Interestingly, pronounced, spatially coordinated response heterogeneities manifest within spheroidal microenvironments: In spheroids grown from genetically identical cells, TRAIL-resistant subpopulations enclose, and protect TRAIL-hypersensitive cells, thereby increasing overall treatment resistance. TRAIL-resistant layers form at the interface of proliferating and quiescent cells and lack both TRAILR1 and TRAILR2 protein expression. In contrast, oxygen, and nutrient deprivation promote high amounts of TRAILR2 expression in TRAIL-hypersensitive cells in inner spheroid layers. COX-II inhibitor celecoxib further enhanced TRAILR2 expression in spheroids, likely resulting from increased ER stress, and thereby re-sensitized TRAIL-resistant cell layers to treatment. Our analyses explain how TRAIL response heterogeneities manifest within well-defined multicellular environments, and how spatial barriers of TRAIL resistance can be minimized and eliminated.Deutsche Forschungsgemeinschaft (German Research Foundation)European Union’s Horizon 2020 research and innovation programCluster of Excellence in Simulation TechnologyProjekt DEA

Efficient and crucial quality control of HAP1 cell ploidy status

The near-haploid human cell line HAP1 recently became a popular subject for CRISPR/Cas9 editing, since only one allele requires modification. Through the gene-editing service at Horizon Discovery, there are at present more than 7500 edited cell lines available and the number continuously increases. The haploid nature of HAP1 is unstable as cultures become diploid with time. Here, we demonstrated some fundamental differences between haploid and diploid HAP1 cells, hence underlining the need for taking control over ploidy status in HAP1 cultures prior to phenotyping. Consequently, we optimized a procedure to determine the ploidy of HAP1 by flow cytometry in order to obtain diploid cultures and avoid ploidy status as an interfering variable in experiments. Furthermore, in order to facilitate this quality control, we validated a size-based cell sorting procedure to obtain the diploid culture more rapidly. Hence, we provide here two streamlined protocols for quality controlling the ploidy of HAP1 cells and document their validity and necessity