NIN-like protein7 and PROTEOLYSIS6 functional interaction enhances tolerance to sucrose, ABA, and submergence

[EN] Nitrate (NO3) assimilation and signaling regulate plant growth through the relevant function of the transcription factor NIN-like Protein7 (NLP7). NO3 is also the main source for plants to produce nitric oxide (NO), which regulates growth and stress responses. NO-mediated regulation requires efficient sensing via the PROTEOLYSIS6 (PRT6)-mediated proteasome-triggered degradation of group VII of ethylene response transcription factors through the Cys/Arg N-degron pathway. The convergence of NO3 signaling and N-degron proteolysis on NO-mediated regulation remains largely unknown. Here, we investigated the functional interaction between NLP7 and PRT6 using Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) double prt6 nlp7 mutant plants as well as complementation lines overexpressing NLP7 in different mutant genetic backgrounds. prt6 nlp7 mutant plants displayed several potentiated prt6 characteristic phenotypes, including slower vegetative growth, increased NO content, and diminished tolerance to abiotic stresses such as high-sucrose concentration, abscisic acid, and hypoxia-reoxygenation. Although NLP7 has an N-terminus that could be targeted by the N-degron proteolytic pathway, it was not a PRT6 substrate. The potential PRT6- and NO-regulated nucleocytoplasmic translocation of NLP7, which is likely modulated by posttranslational modifications, is proposed to act as a regulatory loop to control NO homeostasis and action.This work was supported by MINECO from Spain grant (BIO2017-82945-P), CSIC (2020AEP055), Generalitat Valenciana (PROMETEO/2019/021 grant), and FEDER funds from European Union.Castillo López Del Toro, MC.; Costa-Broseta, Á.; Gayubas, B.; Leon Ramos, J. (2021). NIN-like protein7 and PROTEOLYSIS6 functional interaction enhances tolerance to sucrose, ABA, and submergence. Plant Physiology. 187(4):2731-2748. https://doi.org/10.1093/plphys/kiab38227312748187

Identification of novel seed longevity genes related to oxidative stress and seed coat by genome wide association studies and reverse genetics

[EN] Seed longevity is a polygenic trait of relevance for agriculture and for understanding the effect of environment on the ageing of biological systems. In order to identify novel longevity genes, we have phenotyped the natural variation of 270 ecotypes of the model plant,Arabidopsis thaliana, for natural ageing and for three accelerated ageing methods. Genome-wide analysis, using publicly available single-nucleotide polymorphisms (SNPs) data sets, identified multiple genomic regions associated with variation in seed longevity. Reverse genetics of 20 candidate genes in Columbia ecotype resulted in seven genes positive for seed longevity (PSAD1,SSLEA,SSTPR,DHAR1,CYP86A8,MYB47andSPCH) and five negative ones (RBOHD,RBOHE,RBOHF,KNAT7andSEP3). In this uniform genetic background, natural and accelerated ageing methods provided similar results for seed-longevity in knock-out mutants. The NADPH oxidases (RBOHs), the dehydroascorbate reductase (DHAR1) and the photosystem I subunit (PSAD1) highlight the important role of oxidative stress on seed ageing. The cytochrome P-450 hydroxylase, CYP86A8, and the transcription factors, MYB47, KNAT7 and SEP3, support the protecting role of the seed coat during seed ageing.Ministerio de Ciencia, Innovacion y Universidades, Grant/Award Number: BIO2017-88898-PRenard, J.; Niñoles Rodenes, R.; Martínez-Almonacid, I.; Gayubas, B.; Mateos-Fernández, R.; Bissoli, G.; Bueso Rodenas, E.... (2020). Identification of novel seed longevity genes related to oxidative stress and seed coat by genome wide association studies and reverse genetics. Plant Cell & Environment. 43(10):2523-2539. https://doi.org/10.1111/pce.13822S25232539431

Función de las proteínas VQ1 y VQ10 codificadas por genes inducibles por hipoxia, óxido nítrico, y estrés oxidativo en la regulación del desarrollo y las respuestas a estrés en Arabidopsis thaliana

[ES] Las especies reactivas de oxígeno (ROS), el oxígeno molecular (O2) y el óxido nítrico (NO) son factores comunes en las respuestas a diferentes tipos de estrés en las plantas. En los últimos años, las condiciones ambientales adversas han aumentado debido al cambio climático y, entre ellas, las fuertes lluvias que provocan anegaciones o inundaciones en los campos suponen un grave problema para el desarrollo y el futuro de la agricultura. Estas inundaciones provocan que la planta se enfrente a condiciones de hipoxia severas y a la re-oxigenación que ocurre cuando se retira el agua. Es importante, por tanto, conocer los factores genéticos y moleculares que modulan las respuestas de las plantas a la hipoxia u otros tipos de estrés abiótico para hacer frente a estas situaciones. La familia de proteínas VQ de Arabidopsis thaliana incluye cinco miembros codificados por genes que se inducen en respuesta a la hipoxia, al NO y al estrés oxidativo. Dos de ellos, VQ1 y VQ10, codifican dos proteínas con una gran homología de secuencia y estructura, que no poseen actividad transcripcional. En este trabajo, se describe que VQ1 y VQ10 interaccionan entre sí y con ellas mismas, y con las otras tres proteínas VQ y cuatro factores de transcripción WRKY cuyos genes también se inducen en respuesta a hipoxia, NO y estrés oxidativo. Un rastreo de doble híbrido de levadura de una genoteca de Arabidopsis utilizando VQ1 como cebo permitió identificar alrededor de 300 proteínas interactoras de VQ1 y probablemente también de VQ10, sugiriendo que ambas proteínas tienen patrones similares de interacción proteína-proteína. VQ1 y VQ10 son proteínas citoplásmicas y nucleares, por lo que la identificación de casi 50 proteínas cloroplásticas que interaccionan con VQ1 en el cloroplasto sugiere que estas interacciones deben ocurrir en el citoplasma. En el rastreo se identificó la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS), una enzima clave para la biosíntesis de isoprenoides, la fotosíntesis y el crecimiento de las plantas. Al co-inmunoprecipitar DXS y VQ1 o VQ10 se observó que VQ1 y sobre todo VQ10 favorecieron la monomerización de DXS en un ambiente reductor. A partir de la identificación de un mutante hipermórfico vq10-H se ha procedido a caracterizar algunas de las funciones reguladoras ejercidas por VQ10. El análisis transcriptómico comparado de vq10-H y plantas silvestres Col-0 permitió identificar la regulación ejercida por VQ10 en el desarrollo de las raíces, en las respuestas a NO y estrés oxidativo, así como una potencial función reguladora del procesamiento alternativo de ARNs. La sobreexpresión de VQ10 provocó el aumento de la elongación de la raíz primaria, y de la división y elongación celular en la raíz. También provocó una mayor tolerancia al estrés oxidativo, una menor sensibilidad al NO, y una mayor eficiencia fotosintética en comparación con las plantas silvestres. En conjunto, el trabajo realizado en esta Tesis sugiere que algunas funciones reguladoras de VQ1 y VQ10 en el desarrollo y las respuestas a estrés de las plantas podría estar basado en mecanismos de regulación redox.[CA] Les espècies reactives d'oxigen (ROS), l'oxigen molecular (O2) i l'òxid nítric (NO) són factors comuns en les respostes a diferents tipus d'estrés en les plantes. En els últims anys, les condicions ambientals adverses han augmentat a causa del canvi climàtic i, entre elles, les fortes pluges que provoquen inundacions als camps suposen un greu problema per al desenvolupament i el futur de l'agricultura. Aquestes inundacions provoquen que la planta s'enfronte a condicions d'hipòxia severes i a la re-oxigenació que ocorre quan es retira l'aigua. És important, per tant, conéixer els factors genètics i moleculars que modulen les respostes de les plantes a l'hipòxia o altres tipus d'estrés abiòtic per a fer front a aquestes situacions. La família de proteïnes VQ d'Arabidopsis thaliana inclou cinc membres codificats per gens que s'indueixen com a resposta a l'hipòxia, al NO i a l'estrés oxidatiu. Dos d'ells, VQ1 i VQ10, codifiquen dues proteïnes amb una gran homologia de seqüència i estructura, que no posseeixen activitat transcripcional. En aquest treball, es descriu que VQ1 i VQ10 interaccionen entre si i amb elles mateixes, i amb les altres tres proteïnes VQ i quatre factors de transcripció WRKY, els gens dels quals també s'indueixen com a resposta a hipòxia, NO i estrés oxidatiu. Un rastreig amb la técnica del doble híbrid en llevat d'una genoteca d'Arabidopsis utilitzant VQ1 com a esquer va permetre identificar al voltant de 300 proteïnes interactores de VQ1 i probablement també de VQ10, suggerint que ambdues proteïnes tenen patrons similars d'interacció proteïna-proteïna. VQ1 i VQ10 són proteïnes citoplasmàtiques i nuclears, de manera que la identificació de gairebé 50 proteïnes cloroplàstiques que interaccionen amb VQ1 en el cloroplast suggereix que aquestes interaccions han d'ocorrer al citoplasma. En el rastreig es va identificar la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfat sintasa (DXS), un enzim clau per a la biosíntesi d'isoprenoides, la fotosíntesi i el creixement de les plantes. En co-immunoprecipitar DXS i VQ1 o VQ10 es va observar que VQ1 i sobretot VQ10 van afavorir la monomerització de DXS en un ambient reductor. A partir de la identificación d'un mutant hipermòrfic vq10-H s'ha procedit a caracteritzar algunes de les funcions reguladores exercides per VQ10. L'anàlisi transcriptòmic comparat de vq10-H i plantes silvestres Col-0 va permetre identificar la regulació exercida per VQ10 en el desenvolupament de les arrels, en les respostes a NO i estrès oxidatiu, així com una potencial funció reguladora del processament alternatiu d'ARNs. La sobreexpressió de VQ10 va provocar l'augment de l'elongació de l'arrel primària, i de la divisió i elongació cel·lular a l'arrel. També va provocar una major tolerància a l'estrès oxidatiu, una menor sensibilitat al NO, i una major eficiencia fotosintètica en comparació amb les plantes silvestres. En conjunt, el treball realitzat en aquesta Tesi suggereix que algunes funcions reguladores de VQ1 i VQ10 en el desenvolupament i les respostes a estrés de les plantes podria estar basat en mecanismes de regulació redox.[EN] Reactive oxygen species (ROS), molecular oxygen (O2), and nitric oxide (NO) are common factors in diverse plant stress responses. In the past few years, adverse environmental conditions have increased due to climate change, including heavy rains leading to waterlogging or flooding in fields, posing a serious problem for agriculture's development and future. Floods impose severe hypoxia conditions to plants to be later re-oxygenated when water recedes. Therefore, it is essential to understand the genetic and molecular factors that modulate plant responses to hypoxia and other abiotic stresses to address these situations. The VQ-motif containing protein family in Arabidopsis thaliana includes five members encoded by genes induced in response to hypoxia, NO, and oxidative stress. Two of them, VQ1 and VQ10, encode two proteins with significant sequence and structural homology, lacking transcriptional activity. In this study, it is described that VQ1 and VQ10 interact with each other and themselves, as well as with the other three VQ proteins and four WRKY transcription factors whose genes are also induced in response to hypoxia, NO, and oxidative stress. A yeast two-hybrid screening of an Arabidopsis library using VQ1 as bait allowed us identifying almost 300 VQ1-interacting proteins, that likely also interact with VQ10, suggesting that their homology can be extended to protein-protein interaction patterns. VQ1 and VQ10 are cytoplasmic and nuclear proteins, so the identification of nearly 50 chloroplast proteins interacting with VQ1 in the chloroplast suggests that these interactions may be occurring in the cytoplasm. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS), a key enzyme in isoprenoid biosynthesis, photosynthesis, and plant growth, was identified in the screening. Co-immunoprecipitation of DXS with VQ1 or VQ10 showed that VQ1 and, particularly, VQ10 promoted the monomerization of DXS under reducing conditions. Based on the identification of a hypermorphic vq10-H mutant, some of the regulatory functions exerted by VQ10 have been characterized. Comparative transcriptomic analysis of the hypermorphic vq10-H mutant and Col-0 wild type plants allowed us identifying the regulation exerted by VQ10 in root development, in responses to NO and oxidative stress, as well as in the alternative splicing of RNAs. Overexpression of VQ10 led to increased primary root elongation, and increased root cell division and elongation. It also triggered an enhanced oxidative stress tolerance, reduced sensitivity to NO, and enhanced photosynthetic efficiency compared to wild type plants. Altogether, the work carried out in this thesis suggest that some of the regulatory functions exerted by VQ1 and VQ10 on development and stress responses in plants, could be based on redox mechanisms.Gayubas Balaguer, B. (2023). Función de las proteínas VQ1 y VQ10 codificadas por genes inducibles por hipoxia, óxido nítrico, y estrés oxidativo en la regulación del desarrollo y las respuestas a estrés en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/20257

Expresión en plantas de un sistema de edición genómica CRISPR mediante vectores virales

[ES] La edición dirigida de genomas en plantas va a revolucionar en los próximos años el campo de la mejora de las variedades vegetales y la biotecnología vegetal. De entre las diferentes técnicas de edición de genomas, el sistema CRISPR-Cas ha sido la que ha destacado notablemente. En origen, CRISPR-Cas forma parte del sistema inmune adaptativo de bacterias y arqueas y les permite atacar a cualquier material genético invasor. Existen dos clases de sistemas CRISPRCas y, dentro de cada una de ellas, distintos tipos. De entre ellos, el sistema de tipo II CRISPRCas9 ha sido el que se ha utilizado para su adaptación a la edición de genomas en células de mamífero y en plantas. Sin embargo, últimamente ha surgido el sistema de tipo V CRISPRCpf1 para la edición de genomas, que tiene algunas características que lo hacen más favorable, como la utilización de un único RNA para la edición. De entre las diferentes proteínas de la familia de la Cpf1, las procedentes de Acidaminococcus sp. (AsCpf1) y Lachnospiraceae bacterium (LbCpf1) han demostrado poseer una actividad editora de genes comparable a la de la Cas9 en células de mamífero y en plantas. En este trabajo se ha explorado la posibilidad de expresar un sistema de edición CRISPR-Cpf1 en plantas mediante vectores virales. Para ello se construyó un vector viral derivado del virus del grabado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV) al cual se le insertó el gen de la nucleasa LbCpf1. La construcción del vector se realizó a partir del plásmido pGTEV∆EE, diseñado con el objetivo de crear un vector viral derivado del TEV estable en Escherichia coli y apto para agroinocular plantas. Además, se sabe que a este vector viral se le puede eliminar el gen de la RNA polimerasa viral (NIb) y su función puede ser complementada en trans en células que expresen dicha proteína. Se comprobó que el vector derivado del TEV en el que NIb se reemplazó por LbCpf1 es infeccioso tras agroinocularlo en plantas de Nicotiana tabacum que expresan NIb. Sin embargo, los análisis de la progenie viral en las plantas infectadas indicaron que el virus pierde el inserto de la LbCpf1. No sabemos si el virus expresará la nucleasa un tiempo suficiente para desarrollar su labor de edición genómica. También se construyeron cuatro vectores virales derivados del virus X de la patata (Potato virus X, PVX) a los cuales se les insertaron diferentes construcciones con RNAs CRISPR (crRNAs) para modificar el gen de la fitoeno desaturasa (PDS). Los insertos se componían de las diferentes combinaciones de las repeticiones directas específicas para las nucleasas AsCpf1 o LbCpf1 con las secuencias guía para modificar la PDS de N. tabacum y Nicotiana benthamiana. Mediante agroinoculación de plantas de N. benthamiana, se comprobó que el vector viral que expresa el crRNA correspondiente a LbCpf1 en esta especie es infeccioso. Cuando se dispongan de plantas de N. benthamiana que expresen NIb, cuya construcción está en curso, estos vectores virales se utilizarán para ensayar si es posible editar el genoma de la planta.[EN] Genome editing in plants will revolutionize the field of plant breeding and plant biotechnology in the coming years. Among the different genome editingtechniques, the CRISPR-Cas system has stand out so far. In origin, CRISPR-Cas is part of the adaptive immune system of bacteria and archaea and allows them to attack invading genetic material. There are two types of CRISPR-Cas systems and, within each of them, different types. Among them, the CRISPRCas9 type II system has been adapted to genome editing in mammalian cells and plants. However, more recently the CRISPR-Cpf1 type V system has emerged, with some advantageous features, such as the need of a single RNA. Among the different proteins of the Cpf1 family, those from Acidaminococcus sp. (AsCpf1) and Lachnospiraceae bacterium (LbCpf1) have comparable gene editing activity to that of Cas9 in mammalian cells and plants. In this work, we have explored the possibility of expressing a CRISPR-Cpf1 editing system in plants using viral vectors. We constructed a viral vector derived from the Tobacco etch virus (TEV) in which the nuclease gene LbCpf1 was inserted. The vector was made from the plasmid pGTEVΔEE, designed with the objective of creating a TEV-derived viral vector stable in Escherichia coli and suitable for plantagroinoculation. In addition, it is known that from this viral vector, the viral RNA polymerase (NIb) gene can be deleted while the function can be complemented in trans in cells expressing this protein. The TEV-derived vector in which NIb was replaced by LbCpf1 was infectious after agroinoculation ofNIb-expressing Nicotianatabacum plants. However, the analysis of the viral progeny in the infected plants indicated that the virus loses the LbCpf1 insert. We do not know if the virus will express the nuclease long enough to develop its genomic editing work. Four Potato virusX (PVX)-derived virus vectors were also built and different constructs were inserted inside with CRISPR-RNAs (crRNAs) to modify the phytoene desaturase (PDS) gene. The inserts were composed of the different combinations of the direct repeats specific for the nucleases AsCpf1 or LbCpf1 with the guide sequences to modify the PDS of N. tabacum and Nicotiana benthamiana. By agroinoculation ofN. benthamianaplants, we confirmed that the viral vector that expresses the crRNA corresponding to LbCpf1 is infectious in this species. When N. benthamiana plants expressing NIb, which are under construction, are available, these viral vectors will be used to test whether it is possible to edit the genome of the plant.Gayubas Balaguer, B. (2017). Expresión en plantas de un sistema de edición genómica CRISPR mediante vectores virales. http://hdl.handle.net/10251/86439TFG

Caracterización funcional del mutante sep3-2 en el desarrollo y la longevidad de las semillas de Arabidopsis thaliana

[ES] La biodiversidad vegetal se puede conservar ex situ en bancos de germoplasma, sin embargo, una de sus desventajas es la necesidad de regenerar una gran cantidad de semillas. La viabilidad de las semillas se ve afectada por las condiciones de almacenamiento. El deterioro de la semilla se ve promovido por la oxidación de ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Sin embargo, las semillas poseen mecanismos para reducir el impacto de las especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species, ROS). Entre estos mecanismos se encuentra la formación del glassy citoplasm, la producción de antioxidantes, y la formación de la cubierta de la semilla. La cubierta de la semilla proporciona una barrera entre el embrión y el exterior, aportando protección química y fisiológica. Esta estructura proviene de los integumentos que forman parte del ovario de la flor. El desarrollo de estos integumentos está regulado por genes que codifican para factores de transcripción de la familia MADS-box, como SEEDSTICK (STK), TRANSPARENT TESTA16 (TT16) o GORDITA (GOA). En Arabidopsis thaliana, existe una familia de 4 genes llamados SEPALLATA, que codifican factores de transcripción tipo MADS-box y son fundamentales para el desarrollo floral. Diversos ensayos realizados previamente en el laboratorio sugirieron un papel de estos genes en el desarrollo y la longevidad de las semillas. En este trabajo se ha caracterizado el papel de SEP3 en estos procesos mediante el estudio de la longevidad y de la cubierta de las semillas del mutante de pérdida de función sep3-2 y el mutante de ganancia de función pUB::SEP3 que se desarrolló a lo largo de este trabajo. El mutante sep3-2 mostró tener una alta longevidad de semillas y un muy notable fenotipo de permeabilidad a las sales de tetrazolio, dos resultados que a priori son contradictorios. Tanto los análisis de localización de su expresión y los de la cubierta de las semillas sugirieron que SEP3 actúa en el desarrollo de las capas del integumento interno, sin embargo, no lograron esclarecer el fenotipo de permeabilidad a las sales de tetrazolio. Por otro lado, se vio que las semillas pUB::SEP3 tenían una longevidad significativamente alta y un tamaño mucho mayor. Análisis de expresión génica realizados con los dos mutantes sugirieron que su longevidad podría estar relacionada con una descompensación de los balances hormonales ABA/GA. En estudios futuros debería analizarse genes involucrados en la síntesis y señalización de estas hormonas y medir sus niveles en las semillas de ambos mutantes, además de comprobar la capa de cutina.[EN] Plant biodiversity can be conserved ex situ in seed banks, however, one of its disadvantages is the need to regenerate a large number of seeds. Seed viability is affected by storage conditions. Seed deterioration is promoted by the oxidation of nucleic acids, proteins and lipids. However, seeds have mechanisms to reduce the impact of reactive oxygen species (ROS). Among these mechanisms is the formation of the glassy cytoplasm, antioxidant production, and the seed coat. The seed coat provides a barrier between the embryo and the outside, providing chemical and physiological protection. It is a structure that comes from the integuments that are part of the ovary of the flower. The integument development is regulated by genes that encode MADS-box family transcription factors, such as SEEDSTICK (STK), TRANSPARENT TESTA16 (TT16) or GORDITA (GOA). In Arabidopsis thaliana, there is a 4 gene family named as SEPALLATA, which encode MADS-box transcription factors and are fundamental for floral development. Several tests carried out previously in the laboratory suggested a role for these genes in seed development and longevity. We have characterized the role of SEP3 in these processes by studying seed longevity and the seed coat of the loss-offunction mutant sep3-2 and the gain-of-function mutant pUB::SEP3 that was developed in this study. The sep3-2 mutant has high seed longevity and a very remarkable permeability to tetrazolium salts phenotype, two contradictory results. Gene expression and seed coat analysis suggested that SEP3 acts in inner integument development, however, these analyses did not explain the permeability to the tetrazolium salts phenotype. On the other hand, pUB::SEP3 had significantly higher seed longevity and a much larger seed size. Gene expression analysis with both mutants suggested that their seed longevity could be related to a decompensation of the ABA/GA ratio. In future studies, genes involved in ABA and GA synthesis and signaling could be analyzed and hormone levels could be measured in both mutant seeds. We can also check the cutin layer in the mutant seeds.Gayubas Balaguer, B. (2019). Caracterización funcional del mutante sep3-2 en el desarrollo y la longevidad de las semillas de Arabidopsis thaliana. http://hdl.handle.net/10251/118815TFG

Valine-Glutamine Proteins in Plant Responses to Oxygen and Nitric Oxide

[EN] Multigene families coding for valine-glutamine (VQ) proteins have been identified in all kind of plants but chlorophytes. VQ proteins are transcriptional regulators, which often interact with WRKY transcription factors to regulate gene expression sometimes modulated by reversible phosphorylation. Different VQ-WRKY complexes regulate defense against varied pathogens as well as responses to osmotic stress and extreme temperatures. However,despite these well-known functions, new regulatory activities for VQ proteins are still to be explored. Searching public Arabidopsis thaliana transcriptome data for new potential targets of VQ-WRKY regulation allowed us identifying several VQ protein and WRKY factor encoding genes that were differentially expressed in oxygen-related processes such as responses to hypoxia or ozone-triggered oxidative stress. Moreover, some of those were also differentially regulated upon nitric oxide (NO) treatment. These subsets of VQ and WRKY proteins might combine into different VQ-WRKY complexes, thus representing a potential regulatory core of NO-modulated and O2-modulated responses. Given the increasing relevance that gasotransmitters are gaining as plant physiology regulators, and particularly considering the key roles exerted by O2 and NO in regulating the N-degron pathway-controlled stability of transcription factors, VQ and WRKY proteins could be instrumental in regulating manifold processes in plants.Work on hypoxia in the JL laboratory is supported by grant from Ministerio de Ciencia e Innovación BIO2017-82945-P. BG holds an FPI contract (PRE2018-086290) linked to that grant.León, J.; Gayubas, B.; Castillo López Del Toro, MC. (2021). Valine-Glutamine Proteins in Plant Responses to Oxygen and Nitric Oxide. Frontiers in Plant Science. 11. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.6326781

Subcutaneous anti-COVID-19 hyperimmune immunoglobulin for prevention of disease in asymptomatic individuals with SARS-CoV-2 infection: a double-blind, placebo-controlled, randomised clinical trialResearch in context

Summary: Background: Anti-COVID-19 hyperimmune immunoglobulin (hIG) can provide standardized and controlled antibody content. Data from controlled clinical trials using hIG for the prevention or treatment of COVID-19 outpatients have not been reported. We assessed the safety and efficacy of subcutaneous anti-COVID-19 hyperimmune immunoglobulin 20% (C19-IG20%) compared to placebo in preventing development of symptomatic COVID-19 in asymptomatic individuals with SARS-CoV-2 infection. Methods: We did a multicentre, randomized, double-blind, placebo-controlled trial, in asymptomatic unvaccinated adults (≥18 years of age) with confirmed SARS-CoV-2 infection within 5 days between April 28 and December 27, 2021. Participants were randomly assigned (1:1:1) to receive a blinded subcutaneous infusion of 10 mL with 1 g or 2 g of C19-IG20%, or an equivalent volume of saline as placebo. The primary endpoint was the proportion of participants who remained asymptomatic through day 14 after infusion. Secondary endpoints included the proportion of individuals who required oxygen supplementation, any medically attended visit, hospitalisation, or ICU, and viral load reduction and viral clearance in nasopharyngeal swabs. Safety was assessed as the proportion of patients with adverse events. The trial was terminated early due to a lack of potential benefit in the target population in a planned interim analysis conducted in December 2021. ClinicalTrials.gov registry: NCT04847141. Findings: 461 individuals (mean age 39.6 years [SD 12.8]) were randomized and received the intervention within a mean of 3.1 (SD 1.27) days from a positive SARS-CoV-2 test. In the prespecified modified intention-to-treat analysis that included only participants who received a subcutaneous infusion, the primary outcome occurred in 59.9% (91/152) of participants receiving 1 g C19-IG20%, 64.7% (99/153) receiving 2 g, and 63.5% (99/156) receiving placebo (difference in proportions 1 g C19-IG20% vs. placebo, −3.6%; 95% CI -14.6% to 7.3%, p = 0.53; 2 g C19-IG20% vs placebo, 1.1%; −9.6% to 11.9%, p = 0.85). None of the secondary clinical efficacy endpoints or virological endpoints were significantly different between study groups. Adverse event rate was similar between groups, and no severe or life-threatening adverse events related to investigational product infusion were reported. Interpretation: Our findings suggested that administration of subcutaneous human hyperimmune immunoglobulin C19-IG20% to asymptomatic individuals with SARS-CoV-2 infection was safe but did not prevent development of symptomatic COVID-19. Funding: Grifols