Rational design of inhibitors of the mitochondrial enzyme alternative oxidase (AOX) with fungicide activity against "Moniliophthora perniciosa", causal agent of the witches' broom disease of cocoa

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães PereiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A semente do cacaueiro (Theobroma cacao) é uma das matérias-primas da indústria chocolateira, contudo doenças fúngicas são uma ameaça à cacauicultura e geram perdas de até 30% na produção mundial. No Brasil, o patógeno mais relevante do cacaueiro é o fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, que causou enormes prejuízos após atingir as fazendas baianas em 1989. Além de perdas econômicas, a inviabilização da cacauicultura acarretou severos impactos sociais e ecológicos, tais como desemprego, êxodo rural, crescimento urbano desordenado e desmatamento de florestas nativas. M. perniciosa causa a doença denominada Vassoura de bruxa do cacaueiro (VDB), a qual é atualmente controlada pelo uso de variedades tolerantes de cacaueiro e práticas de manejo agronômico. Porém, ainda não é possível erradicar a VDB após instalada, o que limita a recuperação das fazendas afetadas. Estudos voltados a elucidar os mecanismos moleculares relacionados à patogenicidade de M. perniciosa apontaram para a importância da enzima mitocondrial oxidase alternativa (AOX). A AOX é uma oxidase terminal associada à membrana mitocondrial interna que cria uma ramificação na cadeia transportadora de elétrons no nível do ubiquinol. Apesar de a AOX reduzir a eficiência da síntese de ATP, esta enzima contribui para a homeostase celular em condições normais do desenvolvimento e frente a estresses abióticos e bióticos. Em M. perniciosa, a MpAOX atua como um mecanismo de escape frente à resposta de defesa do cacaueiro e a fungicidas comerciais inibidores da via principal da respiração celular, haja vista que a MpAOX permite o funcionamento parcial da mitocôndria e a sobrevivência do patógeno. Assim sendo, este trabalho teve como principal objetivo gerar informações relevantes para o desenvolvimento de novos inibidores da MpAOX com potencial ação fungicida. Os resultados alcançados são organizados em dois capítulos. No primeiro capítulo, apresenta-se o desenvolvimento de um novo modelo experimental baseado na levedura modelo Pichia pastoris para a triagem e caracterização funcional de derivados de N-fenilbenzamidas (NPD). Através de medições do consumo de oxigênio e da taxa de crescimento de P. pastoris, identificou-se ao menos um inibidor da AOX com ação antifúngica in vitro e in planta. O segundo capítulo aborda a expressão heteróloga, purificação e caracterização funcional da MpAOX. Inibidores do grupo da ascofuranona foram avaliados em ensaios de dose-resposta, permitindo a elucidação de relações estrutura-atividade. Coletivamente, estes resultados representam etapas iniciais para o desenvolvimento de um novo tratamento contra M. perniciosa e outros fungos dependentes da AOX, ultimamente contribuindo para o avanço científico-tecnológico do Brasil em áreas estratégicas, tais como a agricultura e a segurança alimentarAbstract: The cacao tree seeds (Theobroma cacao) are the raw material used in the chocolate industry. However, fungal diseases endanger the world cocoa production and generate losses of 30%. In Brazil, the most important cocoa pathogen is Moniliophthora perniciosa, which devastated farms in the state of Bahia after an outbreak in 1989. In addition to economic losses, M. perniciosa caused severe social and ecological impacts, such as unemployment, rural exodus and uncontrolled urban growth. M. perniciosa is the causal agent of the witches¿ broom disease (WBD) of cocoa, which is currently controlled with tolerant cacao clones and agronomic management practices. Nonetheless, it is not possible to eradicate WBD, which greatly limits the potential for recovery of Brazilian cacao farms. It has been shown that the mitochondrial enzyme alternative oxidase (AOX) is a potential target for the development of new fungicides against M. perniciosa. AOX is a membrane-bound protein associated with the internal membrane in the mitochondria and a terminal oxidase. As such, AOX creates a branching point in the electron transport chain involved in the oxidative phosphorylation, which reduces ATP synthesis, but also confers metabolic plasticity to the cell to resist against a range of abiotic and biotic stresses. In M. perniciosa, MpAOX acts as an escape mechanism against the cacao defense response, as well as fungicides widely used in agriculture. Therefore, the main goal of this work was to generate relevant information for the directed development of MpAOX inhibitors with potential antifungal activity, which are presented in two chapters. The first chapter presents the development of a new experimental model based on the Pichia pastoris yeast for the functional characterization of N-phenylbenzamide derivatives (NPD). Oxygen consumption measurements and growth assays allowed the identification of at least one selective AOX inhibitor with antifungal activity in vitro and in planta. The second chapter addresses the heterologous expression, purification and functional characterization of MpAOX. Ascofuranone and structurally-related AOX inhibitors were subjected to dose-response assays, which led to the identification of key requirements for favorable ligand interaction with MpAOX and other isoforms. Collectively, those results will assist in the targeted development of a novel antifungal agent targeting M. perniciosa and other fungal pathogens dependent on AOX, which will contribute to Brazil's scientific and technological advancement in strategic areas such as agriculture and food securityDoutoradoGenetica de MicroorganismosDoutor em Genetica e Biologia Molecular142358/2014-22014/15339-6FAPESPCNP

Functional studies on cerato-platanins and necrosis- and ethyleneinducing proteins from the causal agent from the witches' broom disease of cocoa, Moniliophthora perniciosa

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Sandra Martha Gomes DiasDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O fungo Moniliophthora perniciosa desperta grande interesse agroeconômico, pois é o agente etiológico da Vassoura-de-Bruxa do cacau. A cultura do cacaueiro é de grande importância no cenário nacional e na América Latina, sendo o entendimento dos mecanismos moleculares desta doença de grande valia. Durante a interação entre patógeno e hospedeiro, o primeiro produz moléculas para evadir ou alterar as respostas normais de defesa do segundo. O sequenciamento do genoma de M. perniciosa levou à identificação de proteínas-chave potencialmente envolvidas no processo patogênico do fungo, dentre as quais, estão: proteínas pertencentes à família das Cerato-plataninas (MpCPs), bem como proteínas pertencentes à família das Necrosis- and Ethylene-inducing Proteins (MpNEPs). As CPs são amplamente associadas à interação fungo-hospedeiro, agindo como toxinas, indutoras de resposta de defesa ou alergenos. As NEPs induzem morte celular e necrose em plantas dicotiledônes através da permeabilização da membrana celular. O objetivo desse projeto foi caracterizar funcionalmente as MpCPs e as MpNEPs, determinando assim sua relevância durante a Vassoura-de-Bruxa. A partir do transcriptoma de M. perniciosa e da análise filogenética das doze MpCPs encontradas, foi revelada uma correlação entre grupos de MpCPs e sua expressão diferencial ao longo da doença. Quatro MpCPs foram clonadas, expressas em sistema heterólogo e tiveram sua estrutura cristalográfica resolvida. Ensaios bioquímicos e biofísicos confirmaram que as MpCPs presentes em diferentes grupos filogenéticos apresentam capacidades distintas no tocante à interação com o açúcar N-acetilglicosamina e de formar agregados ordenados. Estudos funcionais indicaram que estas características estão potencialmente relacionadas ao bloqueio de resposta de defesa da planta e ao crescimento do fungo, respectivamente. Quanto às MpNEPs, somente a isoforma MpNEP2 foi detectada durante a Vassoura-de-Bruxa. A partir da estrutura cristalográfica dessa proteína e ensaios de mutação sítio-dirigida, foi identificado um hairpin hidrofóbico exposto ao solvente, possivelemte associado à ancoragem da MpNEP2 na membrana celular, o qual é tão importante quanto o sítio ativo da proteína para a atividade biológica da mesmaAbstract: Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches' Broom Disease of cocoa and a major agroeconomic concern in Brazil and Latin America. In order to efficiently control this disease, it is crucial to understand the molecular basis underlying its progression. During the attack to the plant, a pathogen releases molecules to suppress or alter the regular defense response of the host. Results obtained from the genome sequencing of M. perniciosa lead to the identification putative virulence factors belonging to the Cerato-platanin protein family (MpCPs), and to the Necrosis- and Ethylene-inducing Proteins (MpNEPs). CPs are important to fungus-host interaction process, acting as toxins, defense response-inducing molecules or allergens. NEPs are toxin-like pore-forming proteins, which affect only dicot plants. This project aimed at the functional characterization of the MpCPs and MpNEPs, as well as understanding their importance for the Witches' Broom Disease progression. Twelve MpCP-coding genes were identified, and comprehensive transcriptome and phylogenetic analyses showed a correlation between MpCPs evolutionary clusters and their expression patterns throughout the disease. Four representative MpCPs had their crystal structure resolved. Biophysical and biochemical characterizations showed a correlation between the MpCP clusters, regarding sugar (N-acetylglucosamine) binding and protein self-assembling, which are possibly related to plant defense response suppression and hyphal growth, respectively. As for the MpNEPs, only the isoform MpNEP2 was shown to be expressed during the Whitches' Broom Disease. Its crystalloghaphic structure, along with site-directed mutagenesis and functional assays revealed that, besides the protein's active site, an hydrophobic hairpin exposed to te solvent is important to the necrosis-promoting activity, probably mediating the contact of MpNEP2 with the cell membraneMestradoGenetica de MicroorganismosMestre em Genética e Biologia Molecula

Functional studies on cerato-platanins and necrosis- and ethyleneinducing proteins from the causal agent from the witches' broom disease of cocoa, Moniliophthora perniciosa

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Sandra Martha Gomes DiasDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O fungo Moniliophthora perniciosa desperta grande interesse agroeconômico, pois é o agente etiológico da Vassoura-de-Bruxa do cacau. A cultura do cacaueiro é de grande importância no cenário nacional e na América Latina, sendo o entendimento dos mecanismos moleculares desta doença de grande valia. Durante a interação entre patógeno e hospedeiro, o primeiro produz moléculas para evadir ou alterar as respostas normais de defesa do segundo. O sequenciamento do genoma de M. perniciosa levou à identificação de proteínas-chave potencialmente envolvidas no processo patogênico do fungo, dentre as quais, estão: proteínas pertencentes à família das Cerato-plataninas (MpCPs), bem como proteínas pertencentes à família das Necrosis- and Ethylene-inducing Proteins (MpNEPs). As CPs são amplamente associadas à interação fungo-hospedeiro, agindo como toxinas, indutoras de resposta de defesa ou alergenos. As NEPs induzem morte celular e necrose em plantas dicotiledônes através da permeabilização da membrana celular. O objetivo desse projeto foi caracterizar funcionalmente as MpCPs e as MpNEPs, determinando assim sua relevância durante a Vassoura-de-Bruxa. A partir do transcriptoma de M. perniciosa e da análise filogenética das doze MpCPs encontradas, foi revelada uma correlação entre grupos de MpCPs e sua expressão diferencial ao longo da doença. Quatro MpCPs foram clonadas, expressas em sistema heterólogo e tiveram sua estrutura cristalográfica resolvida. Ensaios bioquímicos e biofísicos confirmaram que as MpCPs presentes em diferentes grupos filogenéticos apresentam capacidades distintas no tocante à interação com o açúcar N-acetilglicosamina e de formar agregados ordenados. Estudos funcionais indicaram que estas características estão potencialmente relacionadas ao bloqueio de resposta de defesa da planta e ao crescimento do fungo, respectivamente. Quanto às MpNEPs, somente a isoforma MpNEP2 foi detectada durante a Vassoura-de-Bruxa. A partir da estrutura cristalográfica dessa proteína e ensaios de mutação sítio-dirigida, foi identificado um hairpin hidrofóbico exposto ao solvente, possivelemte associado à ancoragem da MpNEP2 na membrana celular, o qual é tão importante quanto o sítio ativo da proteína para a atividade biológica da mesmaAbstract: Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches' Broom Disease of cocoa and a major agroeconomic concern in Brazil and Latin America. In order to efficiently control this disease, it is crucial to understand the molecular basis underlying its progression. During the attack to the plant, a pathogen releases molecules to suppress or alter the regular defense response of the host. Results obtained from the genome sequencing of M. perniciosa lead to the identification putative virulence factors belonging to the Cerato-platanin protein family (MpCPs), and to the Necrosis- and Ethylene-inducing Proteins (MpNEPs). CPs are important to fungus-host interaction process, acting as toxins, defense response-inducing molecules or allergens. NEPs are toxin-like pore-forming proteins, which affect only dicot plants. This project aimed at the functional characterization of the MpCPs and MpNEPs, as well as understanding their importance for the Witches' Broom Disease progression. Twelve MpCP-coding genes were identified, and comprehensive transcriptome and phylogenetic analyses showed a correlation between MpCPs evolutionary clusters and their expression patterns throughout the disease. Four representative MpCPs had their crystal structure resolved. Biophysical and biochemical characterizations showed a correlation between the MpCP clusters, regarding sugar (N-acetylglucosamine) binding and protein self-assembling, which are possibly related to plant defense response suppression and hyphal growth, respectively. As for the MpNEPs, only the isoform MpNEP2 was shown to be expressed during the Whitches' Broom Disease. Its crystalloghaphic structure, along with site-directed mutagenesis and functional assays revealed that, besides the protein's active site, an hydrophobic hairpin exposed to te solvent is important to the necrosis-promoting activity, probably mediating the contact of MpNEP2 with the cell membraneMestradoGenetica de MicroorganismosMestre em Genética e Biologia Molecula

Selection and validation of castor bean (ricinus communis) reference genes for quantitative PCR (RT-qPCR) in developing and germinating seeds and expression pattern of four ricin-family genes

This study aims to expand the set of internal control genes used for RT-qPCR experiments with Castor bean (Ricinus communis) seeds by evaluating candidate genes across several seed tissues and developmental stages. Nine reference genes were selected, including actin-11 (ACT11), tubulin alpha-2 (T alpha 2), elongation factor 1-alpha (EF1-alpha), protein phosphatase 2A-2 (PP2A2), polyubiquitin-3 (PUB3) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Biological samples consisted of R. communis seeds in 15 stages of maturation and germination. We demonstrate that PP2A2, PUB3 and EF1-alpha are the most stably expressed genes across the tested conditions and therefore appropriate for RT-qPCR. Subsequently, those reference genes were used for the analysis of the expression of four R. communis ricin-family genes. In developing seeds, the highest ricin expression levels was seen in the nucellus and in the endosperm, whereas in germinating seeds a peak expression occurs 4-6 days after germination. The four tested ricin isoforms exhibited differential expression patterns across tissues and seed developmental stages, which may indicate distinct biological roles for each ricin gene34CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQnão te

Composição Herbicida Seletiva Para DicotiledÈnea, E Método De Aplicação Da Referida Composição

COMPOSIÇÃO HERBICIDA SELETIVA PARA DICOTILEDÔNEA, E MÉTODO DE APLICAÇÃO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO. Herbicidas são produtos utilizados na agricultura para o controle de ervas classificadas como daninhas. Os mais utilizados pela indústria agrícola são os herbicidas químicos, porém, diversos problemas decorrentes da utilização desse tipo de herbicida precisam ser evitados ou minimizados, dentre eles a contaminação ambiental e a toxicidade a animais. Assim, os herbicidas químicos vêm sendo substituidos pelos herbicidas naturais, os quais compreendem em sua formulação substâncias biologicamente ativas. A presente invenção refere-se á composição herbicida que compreende proteínas com ação sinérgíca Cerato-Platanínas (CP), obtida do fungo Moniliophthora perniciosa, patõgeno que causa a doença Vassoura-de-Bruxa no cacaueiro (Theobroma cacau) e das indutoras de necrose e etileno (NEP) e referido uso para ação seletiva para plantas dicotiledôneas.BRPI0911418 (A2)A01N63/04A01P13/00C07K14/37C07K14/375BR2009PI11418A01N63/04A01P13/00C07K14/37C07K14/37