ErbB receptorok szerepe emlőtumorok terápiájában és prognózisában = Role of erbB receptors in the therapy and prognosis of breast tumors

Eredményeink: Emlő és gyomorrák sejtek felszínén az overexpresszált ErbB2 lipid raftokban helyezkedik el, melyek szabályozzák internalizációját, és kölcsönhatásait más ErbB fehérjékkel. Emellett a β1 integrin is megjelenik a lipid raftokban, mennyisége trastuzumab (TR, anti-ErbB2 terápiás antitest) rezisztens sejtvonalakban magasabb. Az ErbB receptorok lokális stimulációja magas receptor expresszió esetén is lokalizált aktivációhoz vezet, a más ErbB molekulák transzaktiválhatósága a receptorok sűrűségétől függ, és TR rezisztens sejteken az ErbB2 szialomucinok okozta sztérikus gátlás miatt nem köti a TR-t. Optimalizáltuk a FRET mérések fluorofor választását, FRET segítségével megmértük az ErbB2 molekula egyes epitópjainak egymástól és a sejtmembrántól való távolságát, kidolgoztuk a majdnem teljes ErbB2 molekuláris modelljét: feltételezhető, hogy az ErbB2 dimer teljes aktiválásához további ErbB molekulák szükségesek. Kimutatuk, hogy a Hsp90 dajkafehérje stabilizálja az ErbB2-t, megakadályozva aktiválódását és internalizálódását, a Hsp90 gátló 17-AAG hatékony a TR rezisztens tumorok proliferációjának gátlásában is. Rámutatunk, hogy az ErbB1 internalizációjához elegendő egyetlen monoubikvitin c-Cbl általi kapcsolása. Funkcionális ErbB1-eGFP kimérát állítottunk elő, mellyel egyedi ErbB1 molekulák diffúzióját jellemeztük élő sejtek membránjában és szubcelluláris kompartmentjeiben. Módosított membránmodellt dolgoztunk ki, melynek kulcseleme a dinamizmus és a szervezettség. | Results: ErbB2 overexpressed on breast and gastric cancer cells is preferentially localized in lipid rafts that regulate its internalization and interactions with other ErbB proteins. β1 integrins also colocalize in lipid rafts, their quantity is higher in cell lines resistant to trastuzumab (TR, an anti-ErbB2 therapic antibody). Local stimulation of ErbB receptors causes local activation even at high expression levels, transactivation of other ErbBs is a function of receptor density. On TR resistant cells TR binding by ErbB2 is sterically hindered by sialomucins. We have developed a method to optimally choose fluorophor pairs for FRET measurements, determined the distance of various epitopes of ErbB2 from each other and the cell membrane using FRET and used the data to create the nearly full length molecular model of ErbB2, which suggests that further ErbB molecules are needed to fully activate the ErbB2 dimer. Hsp90 appears to stabilize ErbB2 preventing its activation and internalization. Its inhibitor 17-AAG effectively inhibited the proliferation even of TR resistant cancer cells. We showed that a single monoubiquitin ligated by c-Cbl is sufficient for the internalization of ErbB1. We produced a functional ErbB1-eGFP chimera and used it in correlation spectroscopy to characterize diffusion of single ErbB1 molecules in the membrane and subcellular compartments of living cells. We have elaborated a modified membrane model termed dynamically structured mosaic model

ErbB receptorok szerepe epitél eredetű tumorokban: receptor tirozinkinázok, mint a tumor ellenes terápiák lehetséges target molekulái. = Role of ErbB receptors in epithelial tumors: receptor tyrosine kinases as targets for anticancer therapy.

Az erbB2-erbB2 és erbB2-erbB1 molekulák homo- és heteroasszociációja - akárcsak más erbB hetero-oligomereké - fontos szerepet játszhatnak a jelátvitelben így az immunoterápiában is. Kísérleteket végeztünk annak felderítésére, hogyan modulálja ezt a folyamatot más kölcsönható molekulák, pl. integrinek, CD44 (hialuronsav receptor) sejtfelszíni jelenléte. Az ErbB2 ellenes immunterápia (trastuzumab kezelés) során kialakuló trastuzumab rezisztencia lehetséges okait is vizsgáltuk. FRET eredményeink alapján elkészítettük ErbB2 dimer molekuláris modelljét. A trastuzumab rezisztens JIMT-1 ill. MKN-7 valamint a szenzitív SKBR-3 és N87 tumor sejtvonalakon végzett összehasonlító kísérleteink alapján megállapítottuk, hogy a trastuzumab kezelés korai elkezdésével még a rezisztens sejtek esetén is részleges válasz érhető el. A xenograft kísérletek rámutattak arra, hogy az antitest által közvetített citotoxicitás (ADCC) a trastuzumab kezelés kedvező hatásának elsődleges oka. A geldanamycin ill. 17AAG sejtosztódást gátló hatása hatékonyabbnak bizonyult trastuzumab rezisztens sejtekben. Ugyanakkor a CD44 leszabályozása, valamint a hialuronsav szintézis gátlása növelte a trastuzumab kezelés hatékonyságát. Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy célzott adjuváns kezelés nagymértékben fokozhatják a trastuzumab terápia hatékonyságát. | Homo- and heteroassociations of erbB2-erbB2 and erbB2-erbB1 molecules ? similarly to that of other ErbB hetero-oligomers ? play an important role in signal transduction and immunotherapy. Our experiments aimed to reveal whether the cell surface presence of interacting molecules such as integrin and CD44 (receptor for hyaluronic acid) molecules can modulate these processes. We have also studied the possible causes of trastuzumab resistance developing during the ErbB2 targeted immunotherapy. We have prepared a useful molecular model of ErbB2 dimer on he basis or our FRET results. By comparing the behavior of trastuzumab resistant (JIMT-1 and MKN-7) and sensitive (SKBR-3 and N87) tumor cell lines we found that early trastuzumab treatment can be partially beneficial even in resistant cell lines. It was also revealed that the primary reason of the efficacy of trastuzumab treatment in xenograft models is the antibody dependent cell citotoxicity (ADCC). The treatment using geldanamycin or its derivative 17AAG was more efficient in trastuzumab resistant cells than in sensitive cells. Downregulation of CD44 and inhibition of synthesis of hyaluronic acid increased the efficiency of the trastuzumab treatment. These results suggest that targeted adjuvant therapy can significantly enhance the efficacy of the trastuzumab therapy

The Role of Antibody Mediated Cellular Cytotoxicity (ADCC) in the Mechanism Underlying the Action of Trastuzumab

Irodalmi adatok szerint a trastuzumab-érzékeny sejtvonalak esetén a trastuzumab in vivo hatásának mintegy 2/3-ért az immun-mediált mechanizmusok a felelősek. Az általunk használt JIMT-1 sejtvonal jelenleg egyedülálló modell, amellyel egyszerre, elkülönítve lehet vizsgálni a trastuzumab-rezisztencia direkt (in vitro) és immun-mediált formáját (in vivo). Jelen dolgozatban főleg az utóbbi kérdéssel foglalkoztunk. Megmutattuk, hogy az in vitro trastuzumab-rezisztens JIMT-I sejtek in vivo érzékenyek a korán kezdett trastuzumab kezelésre. Trastuzumab-F(ab’)2–vel végzett in vivo kísérleteinkkel bizonyítottuk, hogy a JIMT-1 xenograftok növekedését a trastuzumab-közvetítette ADCC gátolja in vivo. A trastuzumab hatásáért kizárólag az ADCC a felelős. A rezisztencia kialakulása ez eseten a trastuzumab-közvetítette ADCC-vel szembeni rezisztenia kialakulását jelenti. Az ADCC in vitro vizsgálatával megmutattuk, hogy az in vitro trastuzumab-érzékeny és az in vitro rezisztens sejtvonalak ugyanolyan mértékben érzékenyek a trastuzumab-közvetítette ADCC-re in vitro. In vitro ADCC-re érzékenynek találtuk az ADCC-re in vivo rezisztenssé vált xenograftból alapított JIMT-I X+ sejtvonalat is. A JIMT-1 X+ sejtek egerekbe oltva in vivo is érzékenynek bizonyultak, bár a rezisztencia gyorsabban kialakult, mint a JIMT-1 sejteknél. A trastuzumab-F(ab’)2 és a trastuzumab azonos mértékben csökkentette a xenograftok ErbB2 szintjét. Így, mivel az F(ab’)2 a daganatnövekedésre nem hatott, szétválasztottuk a trastuzumab ErbB2-t csökkentő és daganatnövekedést gátló hatását. Kísérletünkben a trastuzumab szignifikánsan csökkentette a vérben keringő és a csontvelői disszeminált daganatos sejtek számát akkor, amikor a primer daganat már nem volt érzékeny a trastuzumab-kezelésre. ----- Trastuzumab is a recombinant antibody drug, which is widely used for the treatment of breast cancer. Despite encouraging clinical results some cancers are primarily resistant to trastuzumab, and a majority of those initially responding become resistant during prolonged treatment. The mechanisms of trastuzumab resistance have not been fully understood. It is well documented that trastuzumab acts directly in cancer cell signaling, as well as indirectly via the immune system. We examined the possible mechanisms of trastuzumab resistance in detail using the breast cancer cell line JIMT-1 established from the pleural metastasis of a patient who was clinically resistant to trastuzumab. Despite ErbB2 gene amplification and receptor overexpression, JIMT-1 cells are resistant to trastuzumab in vitro, and also in vivo, if therapy is initiated 45 days after establishing xenografts. Our main and unexpected finding was that trastuzumab caused a significant growth inhibition of the outgrowth of macroscopic JIMT-1 xenograft tumors in both nude and SCID mice. The effect was probably mediated via the Fc portion of trastuzumab IgG because the F(ab’)2 fragment of trastuzumab was ineffective in the SCID mouse model system, in spite of inhibiting proliferation of trastuzumab sensitive cells in vitro equally well as intact trastuzumab IgG. We attribute the Fc-mediated effects of trastuzumab to ADCC because both nude and SCID mice have functioning macrophages and natural killer cells capable of killing tumor cells by ADCC. These findings reflect the central role of the immune system in mediating the effects of trastuzumab in vivo. In a previous study, Clynes et al. inoculated trastuzumab-sensitive BT 474 cells into knock-out mice lacking activating FcRγIII receptors. In this model system, the antitumor activity of trastuzumab was reduced but not ablated: about 25% of the effect was retained. In the same manner, treatment of wild-type mice with the mutated form of 4D5, the parent antibodyof trastuzumab, which was made unable to bind to Fc receptors, had a similar partial effect. These results indicate that in the case of BT-474 cells, trastuzumab probably triggers both the intrinsic growth-inhibitory and apoptotic regulatory pathways, as well as evokes ADCC. In the case of the intrinsicallyresistant JIMT-1 cells, the mechanism of action of trastuzumab seems to be exclusively ADCC. The mutual independence of the intrinsic and immune-mediated effects was further evidenced by in vitro ADCC experiments using human peripheral leukocytes as effector cells. The capacity of these cells to kill JIMT-1 and SKBR-3 cells in the presence of trastuzumab by ADCC was the same despite significant differences in the direct drug sensitivity assays. Moreover, we found that the downmodulation of ErbB2 receptor from the cell surface upon trastuzumab treatment, which has previously been postulated as the central phenomenon for direct growth inhibition, seems to be mechanistically unrelated to the action of trastuzumab in vivo. Moreover, we found that the down-modulation of ErbB2 receptor from the cell surface upon trastuzumab treatment, which has previously been postulated as the central phenomenon for direct growth inhibition appears to be mechanistically unrelated to the action of trastuzumab in vivo. The subline JIMT-X+, generated from a trastuzumab treated JIMT-1 xenograft, did not differ from the parental JIMT-1 cells in the in vitro ADCC assays. JIMT-1 X+ cells were able to form xenografts in SCID mice and the growth of the xenografts was reduced by trastuzumab administration, suggesting that JIMT-1 X+ cells were initially sensitive to trastuzumab also in vivo; although trastuzumab resistance has developed after 3 weeks. Finally, we showed that trastuzumab therapy was able to reduce the number of both circulating tumor cells (CTC) in the blood and disseminated tumor cells (DTC) in the bone marrow, even when the antibody has already lost its tumor inhibitory effect on the primary tumor. To the best of our knowledge, this is the first study to investigate the effect of trastuzumab on circulating and disseminated tumor cells shed from a trastuzumab resistant primary tumor in a xenograft model. We suggest that ErbB2 expressing CTCs and DTCs may be sensitive to trastuzumab even if trastuzumab resistance of the primary tumor has already developed, especially if the mechanism of resistance is masking of ErbB2. So trastuzumab treatment might have benefit in the case of patients with already trastuzumab-resistant breast cancer