Frozen Jaguar (Panthera onca) sperm capacitation and ability to penetrate zona free hamster oocytes

Assisted reproductive technologies in endangered species, such as artificial insemination, in vitro fertilization and embryo transfer, can be viewed as one potential approach for safeguarding species. Toward this aim, the objective of this study was to evaluate the fertility of frozen jaguar (Panthera onca) sperm and Tyrod's Talp PVA capacitation medium using the hamster zona free oocyte penetration assay. Ejaculates were collected from nine animals using electroejaculation and cryopreserved. Sperm capacitation was performed by swim-up technique using Tyrod's Talp PVA medium at room temperature. Penetration was considered when the spermatozoa head decondensation was visualized within the oocyte. This assay showed 15.4% penetrations (350/2275 oocytes). Results of this study showed high sperm abnormalities, low sperm quality after cryopreservation, and low percentage of penetrations. However, the penetration results showed that the cryopreserved jaguar's semen can be used for artificial insemination, in vitro fertilization and intra cytoplasmatic sperm injection, supporting the semen bank creation for this specie.Biotecnologias reprodutivas aplicadas a espécies selvagens, como inseminação artificial, fertilização in vitro e transferência de embriões, são vistas como um potencial caminho para proteção das espécies ameaçadas de extinção. Devido a isso, o objetivo deste estudo foi avaliar a fertilidade do sêmen congelado de onças pintadas (Panthera onca) e o meio de capacitação espermática usando o ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida. Ejaculados de nove animais foram coletados por eletroejaculação e criopreservados. Para determinar a capacitação espermática foi utilizada a técnica swin-up com meio Tyrods Talp PVA a temperatura ambiente. No ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida foram considerados como oócitos penetrados aqueles que apresentaram em seu interior a cabeça do espermatozóide descondensada. O ensaio foi realizado em um total de 2275 oócitos, dos quais 350 apresentaram em seu interior a cabeça do espermatozóide descondensada, perfazendo um total de 15.4% de penetração. Os resultados deste estudo demonstraram alto índice de anormalidades espermáticas, baixa qualidade do sêmen e baixa porcentagem de penetrações. Entretanto, os resultados de penetração espermática demonstraram que sêmen congelado de onça pintada poderá ser utilizado para inseminação artificial, fertilização in vitro e injeção intracitoplasmática dando suporte para a criação de um banco de sêmen para esta espécie

Melhoramentos em aparelho eletroejaculador para cobaias (Cavia porcellus)

The procedure here described appears repeatable and non-traumatic method of electroejaculation, which might be of utility in studies such as those performed to determine the effects of both radiation and/or drugs on sperm production in the guinea-pig (Cavia porcellus). Essentially, the electro-ejaculator device consists of four distinct and coupled circuits: a power supply, an oscillator circuit with a driver, a timer and a meter circuit, connected to a 110V, 60Hz source. A guinea-pig analogue output (parallel RC circuit) was associated to the apparatus yielding a fixed current of 28 mA. Two electrodes were utilized in order to transfer the electrical signal to the animal: one anal and one lumbar (placed between vertebras L1-L3). The electric pulse, in a maximum number of five, were given at 10 seconds intervals. During semen collections, that performed weekly, the apparatus worked in a AC current (square wave) with a 4 seconds time adjustment for shocks that were delivered in a frequency of 1000Hz. Electrode jelly was applied to the skin to ensure a perfect electrical contact with lumbar electrode. A total of 591 ejaculations were obtained from 53 animals, during 16 weeks; the semen was collected in 2ml Sorensen phosphate butter containing 2 mg alpha-chymotrypsin.RESUMO: Demonstrou-se método de eletroejaculação em cobaias por meio de processo eficiente, não traumático e de repetição, que se mostrou útil para estudos de efeitos de radiações ou drogas sobre a produção espermática. Fundamentalmente, o aparelho eletroejaculador consiste de quatro circuitos distintos, acoplados entre si, constituídos de fontes de alimentação, circuitos oscilador e de estágio de saída, temporizador e circuito de medição, ligado à rede elétrica em 110 V - 60 Hz. Associando uma carga ativa à saída do aparelho foi fixada a intensidade da correnteem 28 mA. Para a transferência do sinal elétrico ao animal, foram utilizados 2 eletrodos, um anal e outro lombar, este posicionado entre as vértebras lombares L2-L3, cuja região foi depilada para receber uma fina camada de pasta para eletrodo, com intuito de melhorar a transmissão dos impulsos elétricos. Estes, em número máximo de 5, foram aplicados em intervalos de 10 segundos e duração de 4 segundos. Ao cessar o primeiro estímulo, o pênis foi manipulado suavemente por meio de movimento de distensão conjugado com leve pressão na glande. Durante as colheitas semanais o aparelho funcionou em AC (onda quadrada) com ajuste de tempo de liberação do choque em 4 segundos e frequência em 1000 Hz. De 53 animais foram obtidas 591 ejaculações, ao longo de 16 semanas, recebendo-se o volume ejaculado em coletor contendo 2 ml de tampão fosfato Sorensen e 2 mg de alfa-quimotrpsina

Comparison of methods fecal glucocorticoids metabolite analyses in ocelots (Leopardus pardalis) submited to hormonal treatment and video-laparoscopy

The objective of this study was to compare two different fecal metabolites extraction protocols32,33 and two commercial kits used to analyse fecal glucocorticoids (cortisol and corticosterone) in ocelots (Leopardus pardalis) submitted to hormonal treatment and video-laparoscopy procedure. Based on hormonal analyses, both extraction protocols exhibited similar performance. One commercial kit (ICN Biomedicals) had better results than another (DPC) on glucocorticoids metabolites evaluation.Dois metódos de extração de metabólitos fecais32,33 e dois conjuntos comerciais ("ImmuChem Doubly Antibody Corticosterone 125I RIA"- ICN Biomedicals e "Coat-a-count Cortisol 125I RIE" - DPC) foram utilizados na mensuração dos metabólitos de glicocorticóides (cortisol e corticosterona) em amostras de fezes de jaguatiricas (Leopardus pardalis) (n=3), antes e após tratamento hormonal e procedimentos de vídeo-laparoscopia. O objetivo desse estudo foi comparar e validar fisiologicamente os diferentes protocolos de extração e diferentes conjuntos comerciais na mensuração hormonal. Não houve diferença significativa com relação ao método de extração dos metabólitos. O conjunto comercial ICN Biomedicals provou ser melhor na detecção de metabólitos fecais de glicocorticóides em jaguatiricas

Cytogenetic analyses of ocelot (Leopardus pardalis) and tigrinus (Leopardus tigrinus) oocytes collected after ovarian stimulation

Este estudo representa a primeira avaliação da maturação nuclear de oócitos por análise citogenética realizada em duas espécies de felídeos brasileiros ameaçados de extinção: L. pardalis (n=5) e L. tigrinus (n=4). Os animais foram submetidos à estimulação ovariana alternada com eCG-hCG e pFSH-pLH a cada quatro meses pelo período de dois anos, perfazendo um total de 6 intervenções. Os oócitos foram recuperados por vídeo-laparoscopia, caracterizados quanto à morfologia e utilizados para determinação dos estágios do ciclo meiótico por análise citogenética e maturação pela caracterização de metáfase II. Dos 33 oócitos de jaguatirica avaliados 12% (n=4) apresentaram cromossomos condensados em seu interior e dos 11 oócitos de gato-do-mato-pequeno avaliados 36% (n=4) apresentaram cromossomos condensados em seu interior, no entanto, nenhum oócito encontrava-se em metáfase II. Avaliação morfológica dos oócitos mostrou as mesmas características encontradas em outros mamíferos. Comparando os tratamentos, não houve diferença significativa (p>0,05) no número total de estruturas ovarianas (folículos e corpos lúteos recentes) observadas em estimulações alternadas sucessivas, nas duas espécies estudadas. Também não houve diferença significativa em relação ao total de estruturas ovarianas encontradas em cada tratamento (5,7±1,2 eCG/hCG; 7,9±0,9 pFSH/pLH) para L. pardalis e (2,6±0,7 eCG/hCG; 2,0±0,5 pFSH/pLH) para L. tigrinus. Apesar das limitações deste experimento e do número reduzido de oócitos avaliados podemos sugerir que a aspiração folicular após estimulação ovariana com eCG/hCG e pFSH/pLH alternadamente resulta na recuperação de oócitos imaturos, que necessitam de cultivo em meios específicos para atingir o estágio de Metáfase IIThis study represents the first assessment of oocyte's nuclear maturation by cytogenetical analysis in two endangered Brazilian felids: L. pardalis (n=5) and L. tigrinus (n=4). Females were treated 6 times with alternating eCG/hCG and pFSH/pLH protocols using an interval of 4 months between each treatment. Ovarian follicular development and oocytes recovery were performed through laparoscopy. Recovered oocytes were submitted to the morphological and cytogenetical analysis in order to evaluate the meiotic cycle and maturation (metaphase II), respectively. In 33 ocelot's oocytes observed 12% (n=4) showed condensed chromosomes and in 11 tigrinu's oocytes observed 36% (n=4) showed condensed chromosomes. However no oocytes in metaphase II were observed. Oocytes morphological evaluation showed the same characteristics were observed in others mammals. Our results suggest that L. pardalis and L. tigrinus do not show a decrease (p>0.05) in ovarian response after repeated and alternate exposure to different gonadotropin treatments. In both L. pardalis and L. tigrinus, no differences (p>0.05) were found regarding to the number of total ovarian structures (total follicles and CL) during successive gonadotropin treatments. There were no differences (p>0.05) regarding to the total number of ovarian structures in L. pardalis (5.7 ± 1.2 eCG/hCG and 7.9 ± 0.9 pFSH/pLH) or L. tigrinus (2.6 ± 0.7 eCG/hCG and 2.0 ± 0.5 pFSH/pLH). With these results we can suggest that follicular aspiration after ovarian stimulation with exogenous gonadotrophins results in immature oocytes, needing in vitro culture in specific mediums for metaphase II stage was observe