Relevanz der Ubiquitinierung für die Resektionsregulation in G1-Phase-Zellen an schwerioneninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen

Infolge endogener und exogener Einflüsse kommt es jeden Tag zu Schäden an der DNA, dem Träger der gesamten genetischen Information. Der DNA-Doppelstrangbruch (DSB) gilt hierbei als schwerwiegendster DNA-Schaden, infolgedessen von der Zelle Signalkaskaden eingeleitet werden, um die entstandenen Schäden über verschiedene Reparaturmechanismen zu beheben. Ein wichtiger Mechanismus zur Regulation der DNA-Schadensantwort (DNA damage response = DDR) ist die posttranslationale Modifikation (PTM) von Proteinen durch Ubiquitinierung. Neben den beiden Haupt-DSB-Reparaturmechanismen, der spezifisch für S/G2 resektionsabhängigen Homologen Rekombination (HR) und der stetig verfügbaren klassischen Variante der Nicht-homologen Endverknüpfung (classical non-homologous end joining = c-NHEJ), besitzt die Zelle zudem die Möglichkeit DSBs während des gesamten Zellzyklus resektionsabhängig über alternative Wege der Endverknüpfung (alt-EJ) oder den resektionsabhängigen Weg des c-NHEJ zu reparieren. Während sich die HR einer homologen Matrize als Vorlage zur Reparatur bedient und daher fehlerfrei vonstattengeht, kommt es sowohl beim klassischen NHEJ (c-NHEJ) als auch bei alternativen Wegen der Endverknüpfung (alt-EJ) häufig zu kleineren Insertionen oder Deletionen, wodurch die Wahrscheinlichkeit für chromosomale Aberrationen deutlich erhöht ist. Die Wahl des Reparaturwegs wird durch den Schritt der DNA-End-Prozessierung durch Resektion entscheidend beeiflusst. Veröffentlichungen zeigten, dass mit steigendem linearen Energietransfer (linear energy transfer = LET) und damit steigender DNA-Schadenskomplexität die DSB-Reparatur nicht nur in S/G2, sondern auch in G1 vermehrt resektionsabhängig verläuft. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Regulation der DNA-End-Resektion in G1-Phase-Zellen nach Induktion komplexer DSBs genauer zu untersuchen. Da veröffentlichte Studien belegten, dass für die DDR und auch Resektion essentielle Proteine in der S/G2-Phase durch Ubiquitinierung reguliert werden, wurde bei den durchgeführten Untersuchungen ein besonderes Augenmerk auf die posttranslationale Modifikation durch Ubiquitinierung als möglichen Resektionsregulator gelegt. Die Relevanz dieser Form der Modifikation für die DDR nach Induktion von DNA-Schäden durch Bestrahlung bestätigten Ubiquitin-Pulldown-Analysen, in denen deutlich zu erkennen war, dass nach Bestrahlung mit Röntgen und vor allem hoch-LET Eisenionenbestrahlung Proteine vermehrt ubiquitiniert wurden. Für S/G2 war bekannt, dass die E3 Ubiquitin-Ligase RNF138 Resektion fördert, indem einerseits der Resektionsantagonist Ku80 infolge dessen Ubiquitinierung durch RNF138 vom Schaden entfernt und exzessivere Resektion ermöglicht wurde. Andererseits wurde beschrieben, dass die Rekrutierung des Resektionsfaktor CtIP durch dessen Ubiquitinierung ebenfalls durch RNF138 erleichtert wird. Eine siRNA-basierte Herunterregulation sowie der komplette Knockout der Ubiquitin-Ligase RNF138 demonstrierte die Wichtigkeit von RNF138 für die Resektion in beiden Zellzyklusphasen, G1 und S/G2, da die Anzahl an Resektions- (RPA-) positiven Zellen nach Induktion komplexer Schäden in RNF138-depletierten Zellen deutlich verringert war. Untersuchungen zum RNF138-Zielprotein Ku80 offenbarten, dass der Resektionsantagonist Ku80 nach Induktion komplexer DSBs ungeachtet der Verfügbarkeit von RNF138 und der Zellzyklusphase von der Schadensstelle entfernt wird. Resektions- und Ubiquitin-Pulldown-Analysen in RNF8-depletierten Zellen deuteten in diesem Zusammenhang vielmehr auf eine Beteiligung von RNF8 bei der Resektionsregulation in G1 durch Ubiquitinierung von Ku80 hin. Studien zum RNF138-Target CtIP zeigten nach Induktion komplexer Schäden durch Ionen- sowie Laserbestrahlung eine deutlich verringerte Rekrutierung des Resektionsfaktors an DSBs nicht nur in RNF138-depeltierten S/G2-, sondern auch in G1-Phase-Zellen. Zudem war mittels Ubiquitin-Pulldown-Analysen in RNF138-KO-Zellen kein CtIP in seiner ubiquitinieten Form nachzuweisen. Dies belegte, dass CtIP auch in G1-Phase-Zellen ein Zielprotein von RNF138 ist. Somit spielt die posttranslationale Modifikation durch Ubiquitinierung auch bei der Regulation der Resektion in G1-Zellen eine wichtige Rolle. Abschließende DSB-Reparatur- sowie Zellüberlebensstudien belegten eine Relevanz der E3 Ubiquitin-Ligase RNF138 für die DSB-Reparatur und das klonogene Zellüberleben nach niedrig-energetischer hoch-LET Kohlenstoffionenbestrahlung (Primärenergie 11,4 MeV/u; LET: 168 keV/µm). Der Vergleich von DSB-Reparaturanalysen durch Bestrahlung mit anderen Strahlenqualitäten induzierter DSBs stellte eine Bedeutung von RNF138 für die DSB-Reparatur sowie das klonogene Zellüberleben mit steigender Komplexität der induzierten Schäden heraus. Zusammenfassend kann demnach festgehalten werden, dass die Ubiquitin-Ligase RNF138 für die Ubiquitinierung des Resektionsfaktors CtIP auch in G1 nach Induktion komplexer Schäden wichtig ist, dass sich Auswirkungen einer RNF138-Defizienz auf die DSB-Reparatur und das klonogene Zellüberleben jedoch erst nach Induktion sehr komplexer Schäden wie durch Kohlenstoffionenbestrahlung (Primärenergie: 11,4 MeV/u; LET: 168 keV/µm) erkennen lassen. Wissend, dass ioneninduzierte, komplexe DSBs unabhängig von der Zellzyklusphase vermehrt resektionsabhängig repariert werden und die Ubiquitin-Ligase RNF138 in beiden Zellzyklusphasen für die DNA-End-Resektion in seiner Funktion CtIP zu ubiquitinieren von entscheidender Bedeutung ist, könnte die Inhibition der Ubiquitin-Ligase ein aussichtsreicher Ansatzpunkt für die Radiotumortherpaie mit Schwerionen darstellen. Während durch Bestrahlung mit Schwerionen im Bereich des Normalgewebes wenig Dosis freigesetzt und Schäden geringer Komplexität hervorgerufen werden, wird der Hauptteil der Dosis im sog. Bragg-Peak im Zielgewebe, dem Tumor, appliziert. Folglich entstehen im Tumorgewebe komplexe Schäden an der DNA, die im Gegensatz zu den weniger komplexen Schäden im umliegenden Normalgewebe resektionsabhängig über CtIP repariert werden müssen, was wiederum die Verfügbarkeit der Ubiquitin-Ligase RNF138 erfordert. Die RNF138-Inhibition könnte somit gezielt das Überleben der Tumorzellen negativ beeinflussen und als Inhibitor des Ubiquitin-Proteasom-Systems in der Tumortherapie in Kombination mit Schwerionenbestrahlung Anwendung finden

The Ubiquitin Ligase RNF138 Cooperates with CtIP to Stimulate Resection of Complex DNA Double-Strand Breaks in Human G1-Phase Cells

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the molecular origin of ionizing-radiation inflicted biological effects. An increase in the ionization density causes more complex, clustered DSBs that can be processed by resection also in G1 phase, where repair of resected DSBs is considered erroneous and may contribute to the increased biological effectiveness of heavy ions in radiotherapy. To investigate the resection regulation of complex DSBs, we exposed G1 cells depleted for different candidate factors to heavy ions or α-particle radiation. Immunofluorescence microscopy was used to monitor the resection marker RPA, the DSB marker γH2AX and the cell-cycle markers CENP-F and geminin. The Fucci system allowed to select G1 cells, cell survival was measured by clonogenic assay. We show that in G1 phase the ubiquitin ligase RNF138 functions in resection regulation. RNF138 ubiquitinates the resection factor CtIP in a radiation-dependent manner to allow its DSB recruitment in G1 cells. At complex DSBs, RNF138′s participation becomes more relevant, consistent with the observation that also resection is more frequent at these DSBs. Furthermore, deficiency of RNF138 affects both DSB repair and cell survival upon induction of complex DSBs. We conclude that RNF138 is a regulator of resection that is influenced by DSB complexity and can affect the quality of DSB repair in G1 cells

The Ubiquitin Ligase RNF138 Cooperates with CtIP to Stimulate Resection of Complex DNA Double-Strand Breaks in Human G1-Phase Cells

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the molecular origin of ionizing-radiation inflicted biological effects. An increase in the ionization density causes more complex, clustered DSBs that can be processed by resection also in G1 phase, where repair of resected DSBs is considered erroneous and may contribute to the increased biological effectiveness of heavy ions in radiotherapy. To investigate the resection regulation of complex DSBs, we exposed G1 cells depleted for different candidate factors to heavy ions or α-particle radiation. Immunofluorescence microscopy was used to monitor the resection marker RPA, the DSB marker γH2AX and the cell-cycle markers CENP-F and geminin. The Fucci system allowed to select G1 cells, cell survival was measured by clonogenic assay. We show that in G1 phase the ubiquitin ligase RNF138 functions in resection regulation. RNF138 ubiquitinates the resection factor CtIP in a radiation-dependent manner to allow its DSB recruitment in G1 cells. At complex DSBs, RNF138′s participation becomes more relevant, consistent with the observation that also resection is more frequent at these DSBs. Furthermore, deficiency of RNF138 affects both DSB repair and cell survival upon induction of complex DSBs. We conclude that RNF138 is a regulator of resection that is influenced by DSB complexity and can affect the quality of DSB repair in G1 cells

The Ubiquitin Ligase RNF138 Cooperates with CtIP to Stimulate Resection of Complex DNA Double-Strand Breaks in Human G1-Phase Cells

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the molecular origin of ionizing-radiation inflicted biological effects. An increase in the ionization density causes more complex, clustered DSBs that can be processed by resection also in G1 phase, where repair of resected DSBs is considered erroneous and may contribute to the increased biological effectiveness of heavy ions in radiotherapy. To investigate the resection regulation of complex DSBs, we exposed G1 cells depleted for different candidate factors to heavy ions or α-particle radiation. Immunofluorescence microscopy was used to monitor the resection marker RPA, the DSB marker γH2AX and the cell-cycle markers CENP-F and geminin. The Fucci system allowed to select G1 cells, cell survival was measured by clonogenic assay. We show that in G1 phase the ubiquitin ligase RNF138 functions in resection regulation. RNF138 ubiquitinates the resection factor CtIP in a radiation-dependent manner to allow its DSB recruitment in G1 cells. At complex DSBs, RNF138′s participation becomes more relevant, consistent with the observation that also resection is more frequent at these DSBs. Furthermore, deficiency of RNF138 affects both DSB repair and cell survival upon induction of complex DSBs. We conclude that RNF138 is a regulator of resection that is influenced by DSB complexity and can affect the quality of DSB repair in G1 cells