Análise ex vivo do potencial antifúngico da molécula plumieridina em Cryptococcus neoformans

Criptococose é uma infecção fúngica invasiva causada pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Esta doença afeta aproximadamente 200.000 indivíduos mundialmente. A alta incidência de mortalidade por meningoencefalite criptococócica associada a problemas de toxicidade, resistência e escassez de terapias antifúngicas torna necessária a pesquisa por novos fármacos. Nosso grupo identificou o potencial terapêutico de um iridóide, plumieridina, isolado do extrato aquoso de sementes de Allamanda polyantha (apocinácea). Sendo assim, o objetivo desse estudo é avaliar as atividades biológicas do composto plumieridina contra C. neoformans. Nós propusemos o uso de um modelo prático para avaliar a eficácia desse composto como tratamento para a criptococcose. Nossa estratégia aborda a infecção de camundongos com uma linhagem fluorescente de C. neoformans, seguida de uma análise de órgãos colonizados baseada na fluorescência. Camundongos foram infectados intranasalmente com linhagens fluorescentes de C. neoformans e tratados com plumieridina ou fluconazol durante 14 dias. Os pulmões e o cérebro foram excisados e examinados no equipamento IVIS LUMINA II, para quantificação da fluorescência e determinação de unidades formadoras de colônia (UFC). A análise por imagem demonstrou uma redução da carga fúngica cerebral e pulmonar de camundongos infectados com C. neoformas. Além disso, para identificar possíveis alvos de plumieridina, estudos in silico foram realizados utilizando o servidor pharmMapper. Entre os alvos preditos, três proteínas envolvidas na via das pirimidinas foram identificadas, timidilato-sintase, orotidine-5’-fosfato-descarboxilase e diidroorotato-desidrogenase. As estruturas de timidilatosintase e orotidina-5’-fosfato-descarboxilase de C. neoformans foram modeladas e submetidas à técnica de docking molecular com a molécula plumieridina, para melhor entender os mecanismos de interação com C. neoformans. Plumieridina interage com os aminoácidos no centro catalítico das enzimas. Além disso, o perfil de expressão de genes de C. neoformans relacionados à via das pirimidinas na presença de plumieridina também foi avaliado por PCR em tempo real (RT-qPCR). Uma diminuição significativa nos níveis de transcrição dos genes da timidilato sintase e da orotidine-5’-fosfato-descarboxilase foi detectada quando as células foram cultivadas na presença de plumieridina. Nossos resultados podem contribuir para descrição e desenvolvimento de novos antifúngicos para o tratamento da criptococose.Cryptococcosis is an invasive fungal infection caused mainly by the pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. This disease affects approximately 200,000 individuals annually worldwide. Currently, antifungal drugs show some limitations related to toxicity and resistance, which emphasizes the importance of search for new drugs. Our group identified the antifungal potential of one iridoid - Plumieridine - isolated from the aqueous extract of Allamanda polyantha (Apocynaceae) seeds. Therefore, the objective of this study is to evaluate the biological activities of plumieridine compound against C. neoformans. We propose the use of a practical model to evaluate the treatment efficacy of this compound against C. neoformans. Our approach involves mice infection with C. neoformans fluorescent strain, followed by fluorescence-based imaging analysis of the colonized organs. Mice were infected intranasally with the fluorescent C. neoformans strain and treated with plumieridine or fluconazole for 14 days. The lung and brain were excised and examined in an IVIS Lumina II instrument to determine fluorescence intensity and for CFU determination. Imaging analysis showed that the treatment with plumieridine reduced the pulmonary and cerebral fungal burden of mice infected with C. neoformans. Moreover, in order to identify a possible target of plumieridine, studies in silico were performed using PharmMapper server. Among the predicted targets, three proteins from the route of pyrimidines were identified, thymidylate synthase, orotidine-5'-phosphate decarboxylase and dihydroorotate dehydrogenase. The structures of thymidylate synthase and orotidine-5'-phosphate decarboxylase were modeled to C.neoformans and docked with plumieridine. We found that plumieridine interact with the amino acids at the catalytic center of the enzymes. Furthermore, the gene expression profile of C. neoformans related to route of pyrimidines in the presence of plumieridine was evaluated by RT-qPCR. A significant decreased in the transcript levels of thymidylate synthase and orotidine-5'-phosphate decarboxylase genes was detected when cells were cultured in the presence of plumieridine. Our results may contribute for description and development of new antifungal compounds for cryptococcosis treatment

A plumieridine-rich fraction from Allamanda polyantha inhibits chitinolytic activity and exhibits antifungal properties against Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a fungal infection caused mainly by the pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. The infection initiates with the inhalation of propagules that are then deposited in the lungs. If not properly treated, cryptococci cells can disseminate and reach the central nervous system. The current recommended treatment for cryptococcosis employs a three-stage regimen, with the administration of amphotericin B, flucytosine and fluconazole. Although effective, these drugs are often unavailable worldwide, can lead to resistance development, and may display toxic effects on the patients. Thus, new drugs for cryptococcosis treatment are needed. Recently, an iridoid named plumieridine was found in Allamanda polyantha seed extract; it exhibited antifungal activity against C. neoformans with a MIC of 250 µg/mL. To address the mode of action of plumieridine, several in silico and in vitro experiments were performed. Through a ligand-based a virtual screening approach, chitinases were identified as potential targets. Confirmatory in vitro assays showed that C. neoformans cell-free supernatant incubated with plumieridine displayed reduced chitinase activity, while chitinolytic activity was not inhibited in the insoluble cell fraction. Additionally, confocal microscopy revealed changes in the distribution of chitooligomers in the cryptococcal cell wall, from a polarized to a diffuse cell pattern state. Remarkably, further assays have shown that plumieridine can also inhibit the chitinolytic activity from the supernatant and cell-free extracts of bacteria, insect and mouse-derived macrophage cells (J774.A1). Together, our results suggest that plumieridine can be a broad-spectrum chitinase inhibitor

Proteínas bioluminescentes : biomarcadores para o monitoramento in vivo da infecção por Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii

A criptococose é uma doença fúngica invasiva causada majoritariamente pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que a infecção causada por C. gattii desenvolve mais frequentemente criptococomas pulmonares, enquanto que C. neoformans estabelece principalmente quadros de meningoencefalite. Embora ocorra essa associação, o mecanismo de disseminação dessas espécies não está completamente elucidado, instigando a utilização de diferentes abordagens na caracterização da infecção. O desenvolvimento de microrganismos bioluminescentes tem permitido o monitoramento em tempo real da infecção em modelos animais. No presente trabalho, diferentes estratégias foram utilizadas para a construção de linhagens de C. neoformans e de C. gattii expressando o gene repórter luciferase Renilla, sem sucesso. Paralelamente, em uma segunda abordagem, bactérias bioluminescentes (BL) foram isoladas de amostras de água marinha coletadas nas adjacências da zona estuarina do rio Tramandaí, com o objetivo de selecionar o cassete lux (CDABE) para a utilização como gene repórter. Todos os isolados apresentaram luminescência a 28°C, mas, quando incubados a 37°C, somente o isolado BL6 permaneceu com uma atividade luminescente consideravelmente reduzida. Portanto as bactérias bioluminescentes pertencentes aos gêneros Vibrio, Photobacterium e Enterovibrio isoladas do rio Tramandaí não apresentaram níveis de emissão de luminescência adequados à temperatura fisiológica humana para a utilização do cassete lux como gene repórter para monitoramento de infecções in vivo.Cryptococcosis is an invasive fungal disease caused mainly by pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. Recent epidemiological studies have suggested that infection with C. gattii develops more frequently pulmonary cryptococcomas, while C. neoformans establishes mainly neurological damages. Although exists this association, the mechanism of dissemination of these species is not completely understood, instigating the use of different approaches for the characterization of the infections. Alternatively, the development of bioluminescent organisms has allowed the real-time monitoring of infection in animal models. In this study, different strategies were used to construct strains of C. neoformans and C. gattii expressing Renilla luciferase reporter gene without success. In a second approach, bioluminescent bacteria (BL) were isolated from seawater samples collected in the vicinity of the river Tramandaí estuarine zone, in order to select the lux cassette (CDABE) for use as a reporter gene. All isolates showed luminescence at 28°C, but when incubated at 37°C, only the isolate BL6 remained with a considerably reduced luminescent activity. Thus, bioluminescent bacteria belonging to the genera Vibrio, Photobacterium and Enterovibrio isolated from Tramandaí river estuary zone presented unsuitable luminescence emission levels at human physiological temperature, preventing the use of lux cassette as a reporter gene in experiments to monitoring cryptococcosis infection

Proteínas bioluminescentes : biomarcadores para o monitoramento in vivo da infecção por Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii

A criptococose é uma doença fúngica invasiva causada majoritariamente pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que a infecção causada por C. gattii desenvolve mais frequentemente criptococomas pulmonares, enquanto que C. neoformans estabelece principalmente quadros de meningoencefalite. Embora ocorra essa associação, o mecanismo de disseminação dessas espécies não está completamente elucidado, instigando a utilização de diferentes abordagens na caracterização da infecção. O desenvolvimento de microrganismos bioluminescentes tem permitido o monitoramento em tempo real da infecção em modelos animais. No presente trabalho, diferentes estratégias foram utilizadas para a construção de linhagens de C. neoformans e de C. gattii expressando o gene repórter luciferase Renilla, sem sucesso. Paralelamente, em uma segunda abordagem, bactérias bioluminescentes (BL) foram isoladas de amostras de água marinha coletadas nas adjacências da zona estuarina do rio Tramandaí, com o objetivo de selecionar o cassete lux (CDABE) para a utilização como gene repórter. Todos os isolados apresentaram luminescência a 28°C, mas, quando incubados a 37°C, somente o isolado BL6 permaneceu com uma atividade luminescente consideravelmente reduzida. Portanto as bactérias bioluminescentes pertencentes aos gêneros Vibrio, Photobacterium e Enterovibrio isoladas do rio Tramandaí não apresentaram níveis de emissão de luminescência adequados à temperatura fisiológica humana para a utilização do cassete lux como gene repórter para monitoramento de infecções in vivo.Cryptococcosis is an invasive fungal disease caused mainly by pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. Recent epidemiological studies have suggested that infection with C. gattii develops more frequently pulmonary cryptococcomas, while C. neoformans establishes mainly neurological damages. Although exists this association, the mechanism of dissemination of these species is not completely understood, instigating the use of different approaches for the characterization of the infections. Alternatively, the development of bioluminescent organisms has allowed the real-time monitoring of infection in animal models. In this study, different strategies were used to construct strains of C. neoformans and C. gattii expressing Renilla luciferase reporter gene without success. In a second approach, bioluminescent bacteria (BL) were isolated from seawater samples collected in the vicinity of the river Tramandaí estuarine zone, in order to select the lux cassette (CDABE) for use as a reporter gene. All isolates showed luminescence at 28°C, but when incubated at 37°C, only the isolate BL6 remained with a considerably reduced luminescent activity. Thus, bioluminescent bacteria belonging to the genera Vibrio, Photobacterium and Enterovibrio isolated from Tramandaí river estuary zone presented unsuitable luminescence emission levels at human physiological temperature, preventing the use of lux cassette as a reporter gene in experiments to monitoring cryptococcosis infection