Determination of a Robust Assay for Human Sperm Membrane Potential Analysis

Mammalian sperm must undergo a complex process called capacitation in order to fertilize the egg. During this process, hyperpolarization of the sperm plasma membrane has been mostly studied in mouse, and associated to its importance in the preparation to undergo the acrosome reaction (AR). However, despite the increasing evidence of membrane hyperpolarization in human sperm capacitation, no reliable techniques have been set up for its determination. In this report we describe human sperm membrane potential (Em) measurements by a fluorimetric population assay, establishing optimal conditions for Em determination. In addition, we have conducted parallel measurements of the same human sperm samples by flow cytometry and population fluorimetry, before and after capacitation, to conclusively address their reliability. This integrative analysis sets the basis for the study of Em in human sperm allowing future work aiming to understand its role in human sperm capacitation.Fil: Baró Graf, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio de Medicina Reproductiva; ArgentinaFil: Ritagliati, Carla. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Stival, Cintia Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Balestrini, Paula Ania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Buffone, Mariano Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio de Medicina Reproductiva; Argentin

Determination of a Robust Assay for Human Sperm Membrane Potential Analysis

Mammalian sperm must undergo a complex process called capacitation in order to fertilize the egg. During this process, hyperpolarization of the sperm plasma membrane has been mostly studied in mouse, and associated to its importance in the preparation to undergo the acrosome reaction (AR). However, despite the increasing evidence of membrane hyperpolarization in human sperm capacitation, no reliable techniques have been set up for its determination. In this report we describe human sperm membrane potential (Em) measurements by a fluorimetric population assay, establishing optimal conditions for Em determination. In addition, we have conducted parallel measurements of the same human sperm samples by flow cytometry and population fluorimetry, before and after capacitation, to conclusively address their reliability. This integrative analysis sets the basis for the study of Em in human sperm allowing future work aiming to understand its role in human sperm capacitation.Fil: Baró Graf, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio de Medicina Reproductiva; ArgentinaFil: Ritagliati, Carla. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Stival, Cintia Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Balestrini, Paula Ania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Buffone, Mariano Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio de Medicina Reproductiva; Argentin

Cascadas de señalización bifásicas que modulan la adquisición de la capacidad fecundante en mamíferos

Los espermatozoides de mamíferos recién eyaculados no tienen la capacidad de fecundar al óvulo. Primero deben atravesar una serie de eventos fisiológicos conocidos como “capacitación”. Este proceso resulta en la adquisición de capacidad para sufrir reacción acrosómica (RA) al enfrentarse a un inductor como la progesterona (Pg), y un cambio en el patrón de motilidad denominado hiperactivación. A nivel molecular, durante la capacitación se dan numerosos eventos entre los cuales se encuentran la activación rápida de la proteína quinasa A (PKA) y la hiperpolarización del potencial de membrana (Em), en donde el interior celular se vuelve más negativo, comparado con el exterior. En humanos, trabajos previos han reportado la existencia de la hiperpolarización del Em asociada a la capacitación, pero sólo en forma cualitativa mediante citometría de flujo o el uso de electrofisiología. Sin embargo, en dichos trabajos no se determinó el cambio en el Em a nivel cuantitativo durante el proceso de capacitación. Teniendo en cuenta esto, en este trabajo nos propusimos optimizar un método para evaluar este parámetro, con el objetivo de estudiar su rol en la capacitación del espermatozoide. Utilizamos un ensayo de fluorimetría poblacional para medir el Em que permite la obtención de un valor absoluto ya que se emplea una curva de calibración interna por condición. Habiendo estandarizado la medición del Em, se evidenció una hiperpolarización de la membrana plasmática significativa en condiciones capacitantes entre muestras normospérmicas; no siendo el caso para muestras no normospérmicas. Esto sugiere que la hiperpolarización se relaciona estrechamente con el estado fisiológico del espermatozoide. En cuanto al rol biológico de la hiperpolarización, se encontró una correlación entre los valores de Em de espermatozoides capacitados y el porcentaje de RA inducida con Pg, donde muestras más hiperpolarizadas tuvieron mayores porcentajes de RA inducida. Sumado a esto, observamos una clara tendencia a la hiperactivación entre aquellas muestras hiperpolarizadas. Estos datos implican que la hiperpolarización de la membrana plasmática juega un papel importante en el proceso de capacitación. Para determinar si la hiperpolarización está asociada a la capacidad fecundante de espermatozoides humanos, medimos el Em de muestras de pacientes destinadas a tratamientos de fecundación in vitro (FIV). Demostramos que muestras espermáticas con porcentajes de FIV exitosos exhiben hiperpolarización del Em con la capacitación, no siendo el caso para aquellas muestras con menores tasas de FIV. Además, se encontró una correlación significativa entre los valores de Em de muestras capacitadas y las tasas de FIV. Mediante un análisis de curva ROC concluimos que el Em de muestras capacitadas es un buen parámetro para discriminar entre tasas de FIV exitosas y no exitosas. Finalmente, realizamos el seguimiento del Em en un grupo de 10 donantes durante 5 semanas. Llegamos a la conclusión de que dicho parámetro es homogéneo y que podría ser incluido en el análisis previo que se realizan los pacientes destinados a tratamientos de reproducción asistida. Para terminar, nos propusimos evaluar los mecanismos moleculares por los cuales el espermatozoide humano alcanza la hiperpolarización asociada a la capacitación. Teniendo en cuenta los resultados previos de nuestro laboratorio en el modelo murino, nos planteamos estudiar el posible rol que cumple PKA en la modulación del Em en el espermatozoide humano. Nuestros experimentos mostraron resultados opuestos a los encontrados en ratón ya que, al inhibir el eje cAMP/PKA, se evidenció una mayor hiperpolarización en lugar de una despolarización celular. Esto sugiere que la regulación del proceso de capacitación en espermatozoides humanos comprende una señalización diferencial de los canales iónicos involucrados que no se ajusta a lo demostrado en el modelo murino. En conclusión, nuestros resultados aportan una integración del conocimiento básico de la capacitación espermática humana para potencialmente contribuir a un manejo más personalizado de los pacientes destinados a tratamientos de reproducción asistida.Fil: Baró Graf, Carolina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentina

Regulation mechanisms and implications of sperm membrane hyperpolarization

Mammalian sperm are unable to fertilize the egg immediately after ejaculation. In order to gain fertilization competence, they need to undergo a series of biochemical and physiological modifications inside the female reproductive tract, known as capacitation. Capacitation correlates with two essential events for fertilization: hyperactivation, an asymmetric and vigorous flagellar motility, and the ability to undergo the acrosome reaction. At a molecular level, capacitation is associated to: phosphorylation cascades, modification of membrane lipids, alkalinization of the intracellular pH, increase in the intracellular Ca2+ concentration and hyperpolarization of the sperm plasma membrane potential. Hyperpolarization is a crucial event in capacitation since it primes the sperm to undergo the exocytosis of the acrosome content, essential to achieve fertilization of the oocyte.Fil: Ritagliati, Carla. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Baró Graf, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Stival, Cintia Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Quantification of Protein Kinase A (PKA) Activity by An in vitro Radioactive Assay Using the Mouse Sperm Derived Enzyme

In order to acquire fertilizing potential, mammalian sperm must undergo a process known as capacitation, which relies on the early activation of Protein Kinase A (PKA). Frequently, PKA activity is assessed in whole-cell experiments by analyzing the phosphorylation status of its substrates in a western-blot. This technique faces two main disadvantages: it is not a direct measure of the kinase activity and it is a time-consuming approach. However, since PKA can be readily obtained from sperm extracts, in vitro assays such as the “radioactive assay” can be performed using the native enzyme. Unlike western-blot, the radioactive assay is a straightforward technique to evaluate PKA activity by quantification of incorporated 32P into a peptidic substrate. This approach easily allows the analysis of different agonists or antagonists of PKA. Since mouse sperm is a rich source of soluble PKA, this assay allows a simple fractionation that renders PKA usable both for in vitro testing of drugs on PKA activity and for following changes of PKA activity during the onset of capacitation.Fil: Stival, Cintia Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Baró Graf, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Visconti, Pablo E.. University of Massachusetts; Estados UnidosFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Everything you ever wanted to know about PKA regulation and its involvement in mammalian sperm capacitation

The 3′, 5′-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) dependent protein kinase (PKA) is a tetrameric holoenzyme comprising a set of two regulatory subunits (PKA-R) and two catalytic (PKA-C) subunits. The PKA-R subunits act as sensors of cAMP and allow PKA-C activity. One of the first signaling events observed during mammalian sperm capacitation is PKA activation. Thus, understanding how PKA activity is restricted in space and time is crucial to decipher the critical steps of sperm capacitation. It is widely accepted that PKA specificity depends on several levels of regulation. Anchoring proteins play a pivotal role in achieving proper localization signaling, subcellular targeting and cAMP microdomains. These multi-factorial regulation steps are necessary for a precise spatio-temporal activation of PKA. Here we discuss recent understanding of regulatory mechanisms of PKA in mammalian sperm, such as post-translational modifications, in the context of its role as the master orchestrator of molecular events conducive to capacitation.Fil: Baró Graf, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Ritagliati, Carla. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Stival, Cintia Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Luque, Guillermina Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Gentile, Iñaki. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Buffone, Mariano Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Disruption of protein kinase A localization induces acrosomal exocytosis in capacitated mouse sperm

Protein kinase A (PKA) is a broad-spectrum Ser/Thr kinase involved in the regulation of several cellular activities. Thus, its precise activation relies on being localized at specific subcellular places known as discrete PKA signalosomes. A-Kinase anchoring proteins (AKAPs) form scaffolding assemblies that play a pivotal role in PKA regulation by restricting its activity to specific microdomains. Because one of the first signaling events observed during mammalian sperm capacitation is PKA activation, understanding how PKA activity is restricted in space and time is crucial to decipher the critical steps of sperm capacitation. Here, we demonstrate that the anchoring of PKA to AKAP is not only necessary but also actively regulated during sperm capacitation. However, we find that once capacitated, the release of PKA from AKAP promotes a sudden Ca2+ influx through the sperm-specific Ca2+ channel CatSper, starting a tail-to-head Ca2+ propagation that triggers the acrosome reaction. Three-dimensional super-resolution imaging confirmed a redistribution of PKA within the flagellar structure throughout the capacitation process, which depends on anchoring to AKAP. These results represent a new signaling event that involves CatSper Ca2+ channels in the acrosome reaction, sensitive to PKA stimulation upon release from AKAP.Fil: Stival, Cintia Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Ritagliati, Carla. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Xu, Xing. State University of Colorado - Fort Collins; Estados UnidosFil: Gervasi, Maria Gracia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. University of Massachussets; Estados UnidosFil: Luque, Guillermina Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Baró Graf, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: De La Vega Beltrn, José Luis. Universidad Nacional Autónoma de México; MéxicoFil: Torres, Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro Internacional Franco Argentino de Ciencias de la Información y de Sistemas. Universidad Nacional de Rosario. Centro Internacional Franco Argentino de Ciencias de la Información y de Sistemas; ArgentinaFil: Darszon, Alberto. Universidad Nacional Autónoma de México; MéxicoFil: Krapf, Diego. State University of Colorado - Fort Collins; Estados UnidosFil: Buffone, Mariano Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Visconti, Pablo E.. University of Massachussets; Estados UnidosFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Membrane hyperpolarization abolishes calcium oscillations that prevent induced acrosomal exocytosis in human sperm

Sperm capacitation is essential to gain fertilizing capacity. During this process, a series of biochemical and physiological modifications occur that allow sperm to undergo acrosomal exocytosis (AE). At the molecular level, hyperpolarization of the sperm membrane potential (Em) takes place during capacitation. This study shows that human sperm incubated under conditions that do not support capacitation (NC) can become ready for an agonist stimulated AE by pharmacologically inducing Em hyperpolarization with Valinomycin or Amiloride. To investigate how Em hyperpolarization promotes human sperm?s ability to undergo AE, live single-cell imaging experiments were performed to simultaneously monitor changes in [Ca2+]i and the occurrence of AE. Em hyperpolarization turned [Ca2+]i dynamics in NC sperm from spontaneously oscillating into a sustained slow [Ca2+]i increase. The addition of progesterone (P4) or K+ to Valinomycin-treated sperm promoted that a significant number of cells displayed a transitory rise in [Ca2+]i which then underwent AE. Altogether, our results demonstrate that Em hyperpolarization is necessary and sufficient to prepare human sperm for the AE. Furthermore, this Em change decreased Ca2+ oscillations that block the occurrence of AE, providing strong experimental evidence of the molecular mechanism that drives the acquisition of acrosomal responsiveness.Fil: Balestrini, Paula Ania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Sanchez Cardenas, Claudia. Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Biotecnología. Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular; MéxicoFil: Luque, Guillermina Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Baró Graf, Carolina. Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Fisiología Celular; MéxicoFil: Sierra, Jessica Mariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Hernández Cruz, Arturo. Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Fisiología Celular; MéxicoFil: Visconti, Pablo E.. University of Massachusetts Amherst. Department of Veterinary and Animal Sciences; Estados UnidosFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Darszon, Alberto. Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Biotecnología. Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular; MéxicoFil: Buffone, Mariano Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

Src is the connecting player between PKA activation and hyperpolarization through SLO3 regulation in mouse sperm

Plasma membrane hyperpolarization is crucial for mammalian sperm to acquire acrosomal responsiveness during capacitation. Among signalling events leading to mammalian sperm capacitation, the immediate activation of protein kinase A plays a pivotal role, promoting the subsequent stimulation of protein tyrosine phosphorylation that associates with fertilizing capacity. We have previously shown that mice deficient on the tyr-kinase cSrc are infertile, and exhibit an improper cauda epididymis development. It is therefore not clear whether lack of sperm functionality is due to problems in epididymal maturation or to the absence of cSrc in sperm. To further address this problem, we investigated the kinetics of cSrc activation using anti phosphor Y416-cSrc antibodies that only recognize active cSrc. Our results provide evidence that cSrc is activated downstream of PKA and that inhibition of its activity blocks the capacitation-induced hyperpolarization of the sperm plasma membrane without blocking the increase in tyrosine phosphorylation that accompany capacitation. In addition, we show that cSrc inhibition also blocked the agonist-induced acrosome reaction and that this inhibition is overcome by pharmacological hyperpolarization. Considering that the capacitation-induced hyperpolarization is mediated by SLO3, we evaluated the action of cSrc inhibitors on heterologously expressed SLO3 channel. Our results indicate that, similarly to SLO1 K+ channels, cSrc blockers decreased significantly SLO3-mediated currents. Altogether these results are consistent with findings that hyperpolarization of the sperm plasma membrane is necessary and sufficient to prepare the sperm for the acrosome reaction and suggest that changes in sperm membrane potential are mediated by cSrc activation.Fil: Stival, Cintia Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: la Spina, Florenza Antonella. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Baró Graf, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Arcelay, Enid. University of Massachussets; Estados UnidosFil: Arranz, Silvia Eda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Ferreira, Juan J.. University of Washington. School of Medicine; Estados UnidosFil: Le Grand, Sibylle. University of Washington. School of Medicine; Estados UnidosFil: Dzikunu, Victor A.. University of Washington. School of Medicine; Estados UnidosFil: Santi, Celia M.. University of Washington. School of Medicine; Estados UnidosFil: Visconti, Pablo E.. University of Massachussets; Estados UnidosFil: Buffone, Mariano Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin