Estudi de les funcions biològiques de les nucleases apoptòtiques EndoG, ExoG i TatD

Les nucleases formen una família de gens conservats evolutivament, que s’han involucrat en la mort cel·lular programada i en la proliferació cel·lular en eucariotes. Una de les nucleases mitocondrials més estudiades és EndoG, la qual va ser identificada pel nostre grup com a nucleasa implicada en degradació de l’ADN al miocardi durant la isquèmia. Tot i així, també presenta una funció rellevant en la fisiologia del cor, ja que la pèrdua de funció d’Endog en cardiomiòcits causa un augment de la massa ventricular esquerra. Recentment, el nostre laboratori ha descobert una funció d’EndoG relacionada amb la proliferació cel·lular. En els darrers anys s’ha suggerit que la nucleasa mitocondrial ExoG, paràleg d’EndoG en eucariotes superiors, podria dur a terme funcions similars a EndoG. Tot i així, encara no s’ha investigat la possible interdependèndia entre ExoG i EndoG tant a nivell d’expressió com en la seva funció sobre la proliferació. D’altra banda, TatD va ser descoberta com una nucleasa relacionada amb l’execució de la mort cel·lular programada en C. elegans. La disminució de TatD en el nematode produeix un fenotip semblant a l’observat amb el silenciament d’Endog. No obstant això, la seva funció en mamífers és desconeguda. En aquest treball es demostra que EndoG, ExoG i TatD tenen una expressió tissular diferencial entre elles. De les tres nucleases, només ExoG es troba més expressada en teixits neonatals respecte als adults (a excepció del cervell) suggerint un paper en el desenvolupament. Dels teixits analitzats, EndoG abunda principalment en el cor, ExoG en cervell i TatD té una distribució homogènia entre els diferents teixits. En quant a la localització subcel·lular, EndoG i ExoG són mitocondrials mentre que TatD, sorprenentment, és citosòlica. Tant la reducció d’Endog com Exog limita la proliferació cel·lular en línies no tumorals i en cultius primaris tridimensionals de glàndules d’un model de càncer d’endometri. En canvi, la disminució de l’expressió de Tatd no té cap efecte en la proliferació. A diferència d’EndoG, ExoG i TatD no canvien de compartiment cel·lular ni participen en la degradació de l’ADN nuclear sota isquèmia experimental en cardiomiòcits ni tampoc en models cel·lulars depenents de caspases. També hem demostrat que ExoG i EndoG regulen la mida dels cardiomiòcits probablement per mecanismes comuns, mentre que TatD no hi és implicada. La generació i estudi del nou model murí Tatd-/- demostra que aquest gen no és essencial per la viabilitat i fertilitat del ratolí. Els ratolins Tatd-/- presenten canvis en l’expressió de diversos transcrits a cor i a cervell que suggereixen un rol en processos que impliquen transport de proteïnes i senyalització cel·lular en aquests teixits. L’anàlisi conductual d’aquest model de ratolí revela dèficits locomotors compatibles amb la fatiga, sense símptomes de depressió i ansietat. En conjunt, les nostres dades mostren que ExoG i EndoG tenen funcions comunes en la regulació del creixement dels cardiomiòcits i en la proliferació cel·lular i que TatD podria estar implicada en la regulació de processos de transport de proteïnes al cor i al cervell, essent important per una correcta funció motora.Las nucleasas forman una familia de genes conservados evolutivamente, que se han involucrado en la muerte celular programada y en la proliferación celular en eucariotas. Una de las nucleasas mitocondriales más estudiadas es EndoG, la cual fue identificada por nuestro grupo como nucleasa implicada en degradación del ADN en el miocardio durante la isquemia. Sin embargo, también presenta una función relevante en la fisiología del corazón, ya que la pérdida de función de Endog en cardiomiocitos causa un aumento de la masa ventricular izquierda. Recientemente, nuestro laboratorio ha descubierto una función de EndoG relacionada con la proliferación celular. En los últimos años se ha sugerido que la nucleasa mitocondrial ExoG, paráloga de EndoG en eucariotas superiores, podría llevar a cabo funciones similares a EndoG. Sin embargo, aún no se ha investigado la posible interdependencia entre ExoG y EndoG tanto a nivel de expresión como en su función sobre la proliferación. Por otra parte, TatD fue descubierta como una nucleasa relacionada con la ejecución de la muerte celular programada en C. elegans. La disminución de TatD en el nematodo produce un fenotipo similar al observado con el silenciamiento de Endog. Sin embargo, su función en mamíferos es desconocida. En este trabajo se demuestra que EndoG, ExoG y TatD tienen una expresión tisular diferente entre ellas. De las tres nucleasas, sólo ExoG se encuentra más expresada en tejidos neonatales respecto a los adultos (a excepción del cerebro) sugiriendo un papel en el desarrollo. De los tejidos analizados, EndoG abunda principalmente en el corazón, ExoG en cerebro y TatD tiene una distribución homogénea entre los diferentes tejidos. En cuanto a la localización subcelular, EndoG y ExoG son mitocondriales mientras que TatD, sorprendentemente, es citosólica. Tanto la reducción de Endog como Exog limita la proliferación celular en líneas no tumorales y en cultivos primarios tridimensionales de glándulas de un modelo de cáncer de endometrio. En cambio, la disminución de la expresión de Tatd no tiene ningún efecto en la proliferación. A diferencia de EndoG, ExoG y TatD no cambian de compartimento celular ni participan en la degradación del ADN nuclear bajo isquemia experimental en cardiomiocitos ni tampoco en modelos celulares dependientes de caspasas. También hemos demostrado que ExoG y EndoG regulan el tamaño de los cardiomiocitos probablemente por mecanismos comunes, mientras que TatD no está implicada. La generación y estudio del nuevo modelo murino Tatd-/- demuestra que este gen no es esencial para la viabilidad y fertilidad del ratón. Los ratones Tatd-/- presentan cambios en la expresión de varios transcritos en corazón y cerebro que sugieren un rol en procesos que implican transporte de proteínas y señalización celular en estos tejidos. El análisis conductual de este modelo de ratón revela déficits locomotores compatibles con la fatiga, sin síntomas de depresión y ansiedad. En conjunto, nuestros datos muestran que ExoG y EndoG tienen funciones comunes en la regulación del crecimiento de los cardiomiocitos y en la proliferación celular y que TatD podría estar implicada en la regulación de procesos de transporte de proteínas en el corazón y el cerebro, siendo importante para una correcta función motora.Nucleases are a family of evolutionarily conserved genes, which have been implicated in programmed cell death and cell proliferation in eukaryotes. One of the most studied mitochondrial nuclease is EndoG, which was identified by our group as a nuclease involved in DNA degradation in the myocardium during ischemia. However, it also plays an important role in the physiology of the heart, as the loss of Endog function in cardiomyocytes causes an increase in left ventricular mass. Recently, our laboratory has discovered a novel EndoG function related to cell proliferation. It has been suggested in recent years that ExoG mitochondrial nuclease, a paralog of EndoG in higher eukaryotes, may perform similar functios to EndoG. However, the interdependence between ExoG and EndoG both in terms of expression and its function on proliferation has not yet been investigated. On the other hand, TatD was discovered as a nuclease related to the execution of programmed cell death in C. elegans. TatD silencing in the nematode produces a phenotype similar to that observed with Endog silencing. However, its function in mammals is unknown. EndoG, ExoG and TatD have different tissue expression between them. Interestingly, ExoG is found to be more expressed in neonatal tissues than in adults (except the brain) suggesting a role in development. EndoG is mainly expressed in heart, whereas ExoG is highly expressed in brain, and TatD has a homogeneous distribution among the analyzed tissues. In terms of subcellular localization, EndoG and ExoG are found in mitochondria, but TatD is a cytosolic protein. Both Endog and Exog reduction limit cell proliferation in non-tumor lines and in three-dimensional primary cultures of an endometrial cancer model. In contrast, decreased Tatd expression has no effect on proliferation. Unlike EndoG, ExoG and TatD do not change cell compartment or participate in the degradation of nuclear DNA under experimental ischemia in cardiomyocytes or in caspase-dependent cell models. We have also shown that ExoG and EndoG, but not TatD, regulate the size of cardiomyocytes probably through common mechanisms. The generation and study of the new mouse model Tatd-/- shows that this gene is not essential for the viability and fertility of the mouse. Tatd-/- mice exhibit changes in the expression of various heart and brain transcripts that suggest a role in several processes involved in protein transport and cell signaling in these tissues. Behavioral analysis of this mouse model revealed locomotor deficits compatible with fatigue, without symptoms of depression and anxiety. Taken together, our data show that ExoG and EndoG have common functions in cardiomyocyte growth and cell proliferation, and TatD could be involved in the regulation of protein transport in heart and brain, being important for a normal motor function

Cardiomyocyte hypertrophy induced by Endonuclease G deficiency requires reactive oxygen radicals accumulation and is inhibitable by the micropeptide humanin.

The endonuclease G gene (Endog), which codes for a mitochondrial nuclease, was identified as a determinant of cardiac hypertrophy. How ENDOG controls cardiomyocyte growth is still unknown. Thus, we aimed at finding the link between ENDOG activity and cardiomyocyte growth. Endog deficiency induced reactive oxygen species (ROS) accumulation and abnormal growth in neonatal rodent cardiomyocytes, altering the AKT-GSK3β and Class-II histone deacethylases (HDAC) signal transduction pathways. These effects were blocked by ROS scavengers. Lack of ENDOG reduced mitochondrial DNA (mtDNA) replication independently of ROS accumulation. Because mtDNA encodes several subunits of the mitochondrial electron transport chain, whose activity is an important source of cellular ROS, we investigated whether Endog deficiency compromised the expression and activity of the respiratory chain complexes but found no changes in these parameters nor in ATP content. MtDNA also codes for humanin, a micropeptide with possible metabolic functions. Nanomolar concentrations of synthetic humanin restored normal ROS levels and cell size in Endog-deficient cardiomyocytes. These results support the involvement of redox signaling in the control of cardiomyocyte growth by ENDOG and suggest a pathway relating mtDNA content to the regulation of cell growth probably involving humanin, which prevents reactive oxygen radicals accumulation and hypertrophy induced by Endog deficiency