Anaerobic fermentation merging the carboxylate and syngas platforms : Harnessing the potential of mixotrophic communities

Bioraffinerien zur Produktion von Plattformchemikalien und Kraftstoffen aus organischen Reststoffen oder Abfällen und Synthesegas (Syngas, d. h. Gemische aus H$_{2}$, CO$_{2}$ und CO) können den Übergang zu einer neuen biobasierten Kreislaufwirtschaft befördern. Unter den vielen infrage kommenden Technologien sind die mikrobielle Kettenverlängerung von Carboxylaten (chain elongation; CE) und die Synthesegasfermentation (SF) zwei vielversprechende Bioprozesse, bei denen anaerobe Bakterien zum Einsatz kommen. Sowohl bei der CE als auch bei der SF müssen jeweils eigene Herausforderungen bewältigt werden, um effiziente und wirtschaftliche Verfahren zu entwickeln. Organische Rest- und Abfallstoffe können durch CE in hochwertige mittelkettige Carboxylate (medium-chain carboxylates; MCCs) umgewandelt werden, wobei mikrobielle Gemeinschaften als Biokatalysatoren eingesetzt werden. Die Ausbeuten und Produktkonzentrationen sind dabei jedoch stark vom Vorhandensein und der Bioverfügbarkeit von Elektronendonoren (ED) im Rohstoff begrenzt. Dank des Wood-Ljungdahl-Wegs (Wood-Ljungdahl pathway; WLP), der in bestimmten Bakterien vorhanden ist, können aber auch H$_{2}$ und CO aus Synthesegas als Quellen für ED herangezogen werden. Für SF gibt es bereits erste kommerzielle Anlagen, die mit CO-reichem Abgas aus Stahlwerken unter Verwendung von Reinkulturen arbeiten, aber ihr Produktspektrum ist auf Grundstoffe wie Acetat und Ethanol beschränkt. Diese Arbeit hat das Ziel, die CE- und SF-Technologien zusammenzuführen, Fermentationen der Carboxylat- und Synthesegasplattformen zu analysieren und deren Durchführbarkeit zu verbessern. Dafür wurde eine Ein-Topf-Prozessstrategie mit anaeroben mikrobiellen Gemeinschaften in den Fokus gestellt, verschiedene Betriebsbedingungen untersucht und chemische Bilanzierungen der Bioreaktoren vorgenommen. Parallel dazu wurde die Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaften analysiert, um mikrobielle Interaktionen, die eine simultane Verwertung von Syngas und organischen Substraten zur Carboxylatproduktion ermöglichen, aufzuklären. Die ersten Sondierungsstudien wurden mit Batch-Systemen durchgeführt. Sie bestätigten, dass mit H$_{2}$/CO$_{2}$ allein nur geringe MCC-Konzentrationen erhalten werden können (bis zu 1,2 g L$^{-1}$ $n$-Caproat) und dass die gleichzeitige Zufuhr eines organischen ED (Ethanol, Laktat oder Zucker aus pflanzlicher Biomasse) notwendig ist, um extrahierbare MCC-Konzentrationen zu erzielen. Die Zugabe von H$_{2}$ im Überschuss hatte einen positiven – wenn auch geringen – Einfluss auf die MCC-Produktion und begünstigte die Anreicherung von Bakterien der Gattungen $Clostridium$ sensu stricto 12, $Eubacterium$, $Megasphaera$ und $Caproiciproducens$. Demgegenüber beeinflusste CO die Entwicklung der Mischkultur stark und hatte eine differenzierte Wirkung auf die Produktbildung, indem es die Gesamtcarboxylatproduktion erhöhte, aber die Selektivität für die verlängerten Carboxylate verringerte. Eine Inokulation mit einer sehr diversen mikrobiellen Gemeinschaft war notwendig, um eine Mischkultur anzureichern, die in der Lage war, Syngas für eine verbesserte MCC-Produktion zu nutzen. Jedoch enthielten solche Inokula auch hydrogenotrophe Methanbildner wie $Methanobacterium$ und $Methanobrevibacter$, die mit 2-Bromethansulfonat (2-BES), Ethylen oder CO gehemmt werden mussten, um eine Umleitung von Elektronen aus dem Substrat in Richtung Methanbildung zu vermeiden. Unter Berücksichtigung der Erfahrungen mit geschlossenen Batch-Systemen wurde ein Reaktor mit Gasrückführung entwickelt, der kontinuierlich betrieben werden kann. Bei den ersten beiden Prototypen handelte es sich um Rührkesselreaktoren (stirred-tank reactors; STRs), die für 84 Tage mit einem organischen Modellsubstrat (Laktat/Acetat) und H$_{2}$/CO$_{2}$-Rezirkulation betrieben wurden. Das Gasrezirkulationssystem sorgte für eine konstant hohe Verfügbarkeit der gasförmigen Substrate und wurde damit zu einem Schlüsselelement für die Anreicherung mixotropher Gemeinschaften. Durch die Verwendung von Ethylen als skalierbarem Methanogenese-Inhibitor wurden die Elektronenselektivität zu $n$-Caproat (von 2,3 % auf 17 %), die Kohlenstofffixierung (bis zu 0,20 g CO$_{2}$ L$^{-1}$ d$^{-1}$) und die Abundanzen acetogener Bakterien ($Clostridium$ sensu stricto 12, $Eubacterium$ und $Colidextribacter$) aufgrund des höheren H$_{2}$/CO$_{2}$-Partialdrucks erhöht. Das Gasrezirkulationskonzept wurde weiter angepasst und getestet: zwei STRs wurden für weitere 139 Tage und zwei Blasensäulenreaktoren (bubble column reactors; BCRs) für 116 Tage betrieben. Im Langzeitbetrieb zeigten sich zwei Haupthindernisse für die mixotrophe MCC-Produktion, nämlich die Kontamination mit Luft und das Auftreten von ethylentoleranten Methanogenen. Im Vergleich zu den anoxischen Reaktoren produzierten die Reaktoren mit Lufteintragsraten zwischen 97 ± 28 und 474 ± 33 ml O$_{2}$ L$^{-1}$ d$^{-1}$ mehr Propionat auf Kosten von $n$-Caproat und wiesen höhere Abundanzen von Actinobakterien auf, die die Clostridien überwuchsen. Die Aktivität von ethylentoleranten $Methanobrevibacter$ war etwa 33 % kleiner als von Methanobrevibacter, die in Abwesenheit von Ethylen angereichert wurden. Dennoch war die Aktivität der ethylentoleranten Methanogenen hoch genug, um Acetogene zu verdrängen. Schließlich wurde in zwei STRs, die 292 Tage lang mit einer Rezirkulation von H$_{2}$, CO$_{2}$, CO und Ethylen betrieben wurden, eine Langzeitwirksamkeit von CO und Ethylen bei deren gleichzeitiger Verwendung als Methanogenesehemmstoff nachgewiesen. Im Reaktor mit Syngasrezirkulation wurde eine an CO angepasste mixotrophe Gemeinschaft angereichert, die die Hälfte ihrer Substrate aus anorganischen ED (d. h. H$_{2}$ und CO) bezog. Die mixotrophe Gemeinschaft wies eine stabile Produktion von $n$-Butyrat (bis zu 5 g L$^{-1}$) und $n$-Caproat (bis zu 4,3 g L$^{-1}$) als Hauptprodukte auf, während sie bis zu 1,4 g CO$_{2}$-Äquivalente L$^{-1}$ d$^{-1}$ in Carboxylate umwandelte. Im Vergleich zu einer rein heterotrophen Gemeinschaft, die Acetat und Laktat verbraucht, produzierte die mixotrophe Gemeinschaft 50 % mehr Carboxylate mit größerer Kettenlänge als Acetat (in Bezug auf Elektronenäquivalente). Die in diesen Gemeinschaften am häufigsten vorkommenden Bakterien und deren wahrscheinliche Funktionen im Stoffwechsel wurden identifiziert. Bakterien, die eng mit $Clostridium$ $luticellarii$ und $Eubacterium$ $aggregans$ verwandt sind, spielten eine Schlüsselrolle im Zusammenhang mit dem mixotrophen CE-Stoffwechsel. Die Entwicklung von Prozessen zur Produktion mittelkettiger Carboxylate mit Hilfe von mixotrophen Gemeinschaften kann den Übergang von unserer derzeitigen auf fossilen Rohstoffen basierenden Wirtschaft zur Bioökonomie unterstützen. Für die Carboxylat-Plattform kann das in dieser Arbeit entwickelte Konzept die MCC-Ausbeuten aus organischen Rohstoffen erhöhen und gleichzeitig die anaerobe Fermentation in einen Prozess mit Netto-Kohlenstoff-fixierung umwandeln. Für die Synthesegas-Plattform bedeutet die Produktion von MCCs die Verwertung von H$_{2}$, CO$_{2}$ und CO zur Gewinnung von Substanzen, die hochwertiger sind als Acetat und Ethanol. In dieser Arbeit werden die wichtigsten Betriebsparameter für syngasgestützte Fermentationen identifiziert, potenzielle Verbesserungsmöglichkeiten bei der Carboxylatproduktion quantifiziert, eine langfristige Prozessstabilität nachgewiesen und die Struktur der mixotrophen Gemeinschaft als Basis solcher Fermentationen aufgeklärt. Damit dient die Arbeit als Grundlage für künftige Scale-up-Projekte, die eine kommerzielle Umsetzung der syngasgestützten anaeroben Fermentation anstreben

Mixotrophic chain elongation with syngas and lactate as electron donors

Feeding microbial communities with both organic and inorganic substrates can improve sustainability and feasibility of chain elongation processes. Sustainably produced H2, CO2, and CO can be co-fed to microorganisms as a source for acetyl-CoA, while a small amount of an ATP-generating organic substrate helps overcome the kinetic hindrances associated with autotrophic carboxylate production. Here, we operated two semi-continuous bioreactor systems with continuous recirculation of H2, CO2, and CO while co-feeding an organic model feedstock (lactate and acetate) to understand how a mixotrophic community is shaped during carboxylate production. Contrary to the assumption that H2, CO2, and CO support chain elongation via ethanol production in open cultures, significant correlations (p < 0.01) indicated that relatives of Clostridium luticellarii and Eubacterium aggregans produced carboxylates (acetate to n-caproate) while consuming H2, CO2, CO, and lactate themselves. After 100 days, the enriched community was dominated by these two bacteria coexisting in cyclic dynamics shaped by the CO partial pressure. Homoacetogenesis was strongest when the acetate concentration was low (3.2 g L−1), while heterotrophs had the following roles: Pseudoramibacter, Oscillibacter, and Colidextribacter contributed to n-caproate production and Clostridium tyrobutyricum and Acidipropionibacterium spp. grew opportunistically producing n-butyrate and propionate, respectively. The mixotrophic chain elongation community was more efficient in carboxylate production compared with the heterotrophic one and maintained average carbon fixation rates between 0.088 and 1.4 g CO2 equivalents L−1 days−1. The extra H2 and CO consumed routed 82% more electrons to carboxylates and 50% more electrons to carboxylates longer than acetate. This study shows for the first time long-term, stable production of short- and medium-chain carboxylates with a mixotrophic community

Formate-induced CO tolerance and methanogenesis inhibition in fermentation of syngas and plant biomass for carboxylate production

Background: Production of monocarboxylates using microbial communities is highly dependent on local and degradable biomass feedstocks. Syngas or different mixtures of H$_2$, CO, and CO$_2$ can be sourced from biomass gasification, excess renewable electricity, industrial off-gases, and carbon capture plants and co-fed to a fermenter to alleviate dependence on local biomass. To understand the effects of adding these gases during anaerobic fermentation of plant biomass, a series of batch experiments was carried out with different syngas compositions and corn silage (pH 6.0, 32 °C). Results: Co-fermentation of syngas with corn silage increased the overall carboxylate yield per gram of volatile solids (VS) by up to 29% (0.47 ± 0.07 g gVS$^{−1}$; in comparison to 0.37 ± 0.02 g gVS$^{−1}$ with a N$_2$/CO$_2$ headspace), despite slowing down biomass degradation. Ethylene and CO exerted a synergistic effect in preventing methanogenesis, leading to net carbon fixation. Less than 12% of the electrons were misrouted to CH$_4$ when either 15 kPa CO or 5 kPa CO + 1.5 kPa ethylene was used. CO increased the selectivity to acetate and propionate, which accounted for 85% (electron equivalents) of all products at 49 kPa CO, by favoring lactic acid bacteria and actinobacteria over n-butyrate and n-caproate producers. Inhibition of n-butyrate and n-caproate production by CO happened even when an inoculum preacclimatized to syngas and lactate was used. Intriguingly, the effect of CO on n-butyrate and n-caproate production was reversed when formate was present in the broth. Conclusions: The concept of co-fermenting syngas and plant biomass shows promise in three aspects: by making anaerobic fermentation a carbon-fixing process, by increasing the yields of short-chain carboxylates (propionate and acetate), and by minimizing electron losses to CH$_4$. Moreover, a model was proposed for how formate can alleviate CO inhibition in certain acidogenic bacteria. Testing the fermentation of syngas and plant biomass in a continuous process could potentially improve selectivity to n-butyrate and n-caproate by enriching chain-elongating bacteria adapted to CO and complex biomass

Effect of Oxygen Contamination on Propionate and Caproate Formation in Anaerobic Fermentation = Efecto de la contaminación con oxígeno en la formación de propionato y caproato en fermentación anaeróbica

Abstract: Mixed microbial cultures have become a preferred choice of biocatalyst for chain elongation systems due to their ability to convert complex substrates into medium chain carboxylates. However, the complexity of the effects of process parameters on the microbial metabolic networks is a drawback that makes the task of optimizing product selectivity challenging. Here, we studied the effects of small air contaminations on the microbial community dynamics and the product formation in anaerobic bioreactors fed with lactate, acetate and H2/CO2. Two stirred tank reactors and two bubble column reactors were operated with H2/CO2 gas recirculation for 139 and 116 days, respectively, at pH 6.0 and 32°C with a hydraulic retention time of 14 days. One reactor of each type had periods with air contamination (between 97 ± 28 and 474 ± 33 mL O2 L−1 d−1, lasting from 4 to 32 days), while the control reactors were kept anoxic. During air contamination, production of n-caproate and CH4 was strongly inhibited, whereas no clear effect on nbutyrate production was observed. In a period with detectable O2 concentrations that went up to 18%, facultative anaerobes of the genus Rummeliibacillus became predominant and only n-butyrate was produced. However, at low air contamination rates and with O2 below the detection level, Coriobacteriia and Actinobacteria gained a competitive advantage over Clostridia and Methanobacteria, and propionate production rates increased to 0.8–1.8 mmol L−1 d−1 depending on the reactor (control reactors 0.1–0.8 mmol L−1 d−1). Moreover, i-butyrate production was observed, but only when Methanobacteria abundances were low and, consequently, H2 availability was high. After air contamination stopped completely, production of n-caproate and CH4 recovered, with n-caproate production rates of 1.4–1.8 mmol L−1 d−1 (control 0.7–2.1 mmol L−1 d−1). The results underline the importance of keeping strictly anaerobic conditions in fermenters when consistent n-caproate production is the goal. Beyond that, micro-aeration should be further tested as a controllable process parameter to shape the reactor microbiome. When odd-chain carboxylates are desired, further studies can develop strategies for their targeted production by applying micro-aerobic conditions

Hydrogen as a Co-electron Donor for Chain Elongation With Complex Communities

Electron donor scarcity is seen as one of the major issues limiting economic production of medium-chain carboxylates from waste streams. Previous studies suggest that co-fermentation of hydrogen in microbial communities that realize chain elongation relieves this limitation. To better understand how hydrogen co-feeding can support chain elongation, we enriched three different microbial communities from anaerobic reactors (A, B, and C with ascending levels of diversity) for their ability to produce medium-chain carboxylates from conventional electron donors (lactate or ethanol) or from hydrogen. In the presence of abundant acetate and CO$_{2}$, the effects of different abiotic parameters (pH values in acidic to neutral range, initial acetate concentration, and presence of chemical methanogenesis inhibitors) were tested along with the enrichment. The presence of hydrogen facilitated production of butyrate by all communities and improved production of i-butyrate and caproate by the two most diverse communities (B and C), accompanied by consumption of acetate, hydrogen, and lactate/ethanol (when available). Under optimal conditions, hydrogen increased the selectivity of conventional electron donors to caproate from 0.23 ± 0.01 mol e$^{-}$/mol e$^{-}$ to 0.67 ± 0.15 mol e$^{-}$/mol e$^{-}$ with a peak caproate concentration of 4.0 g L$^{-1}$. As a trade-off, the best-performing communities also showed hydrogenotrophic methanogenesis activity by Methanobacterium even at high concentrations of undissociated acetic acid of 2.9 g L$^{-1}$ and at low pH of 4.8. According to 16S rRNA amplicon sequencing, the suspected caproate producers were assigned to the family Anaerovoracaceae (Peptostreptococcales) and the genera Megasphaera (99.8% similarity to M. elsdenii), Caproiciproducens, and Clostridium sensu stricto 12 (97–100% similarity to C. luticellarii). Non-methanogenic hydrogen consumption correlated to the abundance of Clostridium sensu stricto 12 taxa (p < 0.01). If a robust methanogenesis inhibition strategy can be found, hydrogen co-feeding along with conventional electron donors can greatly improve selectivity to caproate in complex communities. The lessons learned can help design continuous hydrogen-aided chain elongation bioprocesses