Study of the regulation of Kv1.3 channels by sterols in in vitro and ex vivo systems

A koleszterin a sejtmembrán egyik alapvető építőeleme, valamint számos biológiailag aktív molekula előanyaga. A vér emelkedett koleszterintartalmával járó hiperkoleszterinémia az egyik leggyakoribb zsíranyagcsere-zavar. Kevésbé ismertek a koleszterinbioszintézis veleszületett károsodásával járó genetikai betegségek (pl. Smith-Lemli-Opitz szindróma, SLOS), ahol a koleszterinszint csökkenése mellet a különböző előalakok felhalmozódnak a vérben és szövetekben. A T-sejtek koleszterintartalmának in vitro módosítása megváltoztatja a sejtek aktivációjához nélkülözhetetlen Kv1.3 ioncsatorna működését, azonban nincs olyan átfogó tanulmány, mely igazolná ennek kórélettani jelentőségét. Kísérleteinkben hiperkoleszterinémiás, illetve Smith-Lemli-Opitz szindrómában szenvedő betegekből izoláltunk limfocitákat, és vizsgáltuk a megváltozott membránkoleszterin összetételének hatását a Kv1.3 ioncsatornák és a T-sejtek működésére. A szterolok Kv1.3 ioncsatornákra gyakorolt hatásának részletesebb megértéséért megvizsgáltuk a Kv1.3 C-terminálisán található, feltételezett koleszterinkötő helyek szerepét a sejtmembrán in vitro módosított membrán koleszterinösszetétele mellett. A kísérletek alapján elmondható, hogy a hiperkoleszterinémia nem befolyásolta jelentősen a Kv1.3 működését, szemben a korábbi in vitro eredményekkel. Ennek oka az lehet, hogy a hiperkoleszterinémiás sejtek koleszterintartalma nem éri el a koleszterinnel töltött sejtekét. Ezt támasztja alá egy kiugróan magas koleszterinnel rendelkező személy T-sejtjeinek vizsgálata, ugyanis esetében az in vitro töltéshez hasonló eredményeket kaptunk. Ezek alapján úgy tűnik, hogy hiperkoleszterinémia esetében csak kiugróan magas szérumkoleszterin-értékeknél kell számítani a Kv1.3 ioncsatorna működésének megváltozására. A limfociták osztódási képessége a Kv1.3 ioncsatorna állapotától függetlenül csökkent. Smith-Lemli-Opitz szindrómában lassult a csatorna kinetikája (aktiváció, inaktiváció) és az egyensúlyi aktiváció jobbra tolódott. Hasonló eltéréseket találtunk az egészséges sejtek 7DHC töltését követően. Az ioncsatornák által szabályozott T-sejt funkciók közül az aktiváció és a proliferáció is zavart szenvedett. A C-terminálison található feltételezett koleszterinkötő helyek mutációja csökkentette a csatorna szterolokkal szembeni érzékenységét. Eredményeinket összefoglalva elmondhatjuk, hogy a sejtmembrán szterolösszetételének in vivo megváltozása az ioncsatornák működésének befolyásolásán keresztül kórélettani következményekkel járhat, hozzájárulva például az SLOS-ben talált neurológiai és kardiovaszkuláris tünetek kialakulásához.Cholesterol is an essential component of the cell membrane and involved in the syntheses of many bioactive molecules. Hypercholesterinemia, which is characterized by the abnormally elevated serum cholesterol level, is a frequent dyslipidemia. Inborn errors of cholesterol synthesis (e.g. Smith-Lemli-Opitz syndrome, SLOS) are rare, genetic disorders with pathognomonic low cholesterol and increased cholesterol precursor serum levels. In vitro manipulation of the membrane cholesterol of T cells modifies the gating parameters of the essential voltage-gated Kv1.3 channel, however a comprehensive study that confirms the pathophysiological significance of these results is missing. Therefore we isolated lymphocytes from patient with SLOS and hypercholesterinemia to study the consequence of in vivo altered membrane cholesterol composition on Kv1.3 channel and T lymphocyte function. To expand our knowledge about the interaction of sterols with Kv1.3 we searched for the existence of cholesterol recognition sites in an in vitro modified sterol environment. Our results indicated that hypercholesterinemia just slightly altered the Kv1.3 function unlike in our former study where in vitro cholesterol loading had remarkable effects. The reason of this could be that the cholesterol content of the cells in hypercholesterolemia is not as high as in the in vitro model systems. This is supported by the data obtained in a patient with extreme high cholesterol level: changes in Kv1.3 biophysical parameters were comparable to those described for the in vitro loaded T cells. The proliferation capacity of the T cells decreased regardless of the lack in the Kv1.3 function. In SLOS the kinetics of Kv1.3 gating slowed down and the steady-state activation shifted toward positive potentials. Identical changes in Kv1.3 operation were observed when control/healthy T cell membrane was loaded with 7DHC. Functional assays exhibited impaired activation and proliferation rate of T cells probably partially due to the modified Kv1.3 operation. Removal of the putative sterol binding sites on Kv1.3 resulted in a phenotype that was not influenced by the elevation in membrane sterol level. We suppose that in hypercholesterinemia only the extreme high serum cholesterol levels influence biological functions of Kv1.3 significantly. We also concluded that the altered membrane sterol composition in SLOS hindered the operation of Kv1.3 as well as the ion channel-controlled T cell functions. We propose that the ion channel-sterol interaction described in our study reveals a molecular mechanism that may contribute to the pathophysiological conditions in SLOS, and may lead to the most prominent neurological and cardiovascular symptoms via influencing the physiological function of ion channels.N

Isolation, chemical and functional characterization of several new K+-channel blocking peptides from the venom of the scorpion Centruroides tecomanus

K

The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation

K

The C-terminal HRET sequence of Kv1.3 regulates gating rather than targeting of Kv1.3 to the plasma membrane

L

7DHC-induced changes of Kv1.3 operation contributes to modified T cell function in Smith-Lemli-Opitz syndrome.

In vitro manipulation of membrane sterol level affects the regulation of ion channels and consequently certain cellular functions; however, a comprehensive study that confirms the pathophysiological significance of these results is missing. The malfunction of 7-dehydrocholesterol (7DHC) reductase in Smith-Lemli-Opitz syndrome (SLOS) leads to the elevation of the 7-dehydrocholesterol level in the plasma membrane. T lymphocytes were isolated from SLOS patients to assess the effect of the in vivo altered membrane sterol composition on the operation of the voltage-gated Kv1.3 channel and the ion channel-dependent mitogenic responses. We found that the kinetic and equilibrium parameters of Kv1.3 activation changed in SLOS cells. Identical changes in Kv1.3 operation were observed when control/healthy T cells were loaded with 7DHC. Removal of the putative sterol binding sites on Kv1.3 resulted in a phenotype that was not influenced by the elevation in membrane sterol level. Functional assays exhibited impaired activation and proliferation rate of T cells probably partially due to the modified Kv1.3 operation. We concluded that the altered membrane sterol composition hindered the operation of Kv1.3 as well as the ion channel-controlled T cell functions

A harmadik szinapszis. Molekuláris kölcsönhatások az elhaló sejtek és az azokat eltávolító makrofágok, dendritikus sejtek között. = The third synapsis. Molecular interactions between dying cells and macrophages or dendritic cells.

A tudományos iskola keretében új interdiszciplináris kutatási terület megteremtésére került sor az apoptótikus sejtek és az azokat eltávolító sejtek közötti harmadi szinapszis tanulmányozására. Megállapítottuk, hogy a transzglutamináz 2 (TG2) enzim szerepet játszik az apoptotikus sejtek eltávolításában, az enzim hiányában autoimmun kórkép alakúl ki. A TG2 bejuthat a sejmagba, sejtbiokémiai hatása összefügg génkifejeződés befolyásolásával. Alzheimer kórban a TG2 résztvesz kovalensen összekötött fehérje aggregátumok létrehozásában. A TG2 védőhatást fejt ki a sejtelhalással szemben májsejtekben és szívizomsejtekben G fehérje, ill. protein diszulfid izomeráz aktivitásával. A PPAR? szerepet játszik az apoptótikus sejteket eltávolító fagocitáló képesség kialakításában fokozva fagocitózis gének kifejeződését. A PPAR?, a retinoid receptor és az LXR receptor szignál utak összekapcsolódnak a makrofágok koleszterol szintjének szabályozásában. A PPAR? aktiváció hatására a dendritikus sejekből fokozott fagocitózisra, hatékony lipid prezentációra és iNKT aktivitásra képes alpopuláció alakul. Apopto-fagocita Taqman Low Density Array-t fejleszttünkl 94 gén mennyiségi kifejeződése vizsgálatára. Az autofágiával elhaló sejtek eltávolítása szintén fagocitózissal történik, specifikus gének indukálódnak. A dendritikus sejtek kölcsönhatása apoptótikus vagy nekrotikus sejtekkel alkalmas az immunválasz finom szabályozására. | In the supported Research School a new interdisciplinary research area has been developed to study the third synapse formed between apoptotic cells and those which engolfe them. It has been established that the transglutaminase 2 (TG2) enzyme plays an important role in the clearance of apoptotic cells, the lack of this enzyme leads to autoimmune disease. TG2 can enter the nucleus and its cell biochemical effects are related to modulation of gene expression and modification of the cytoskeleton. In Alzheimer's disease TG2 participates in the formation of covalently cross-linked protein aggregates. TG2 can protect hepatocytes and cardiomyocytes against apoptosis through its G protein and protein disulphide isomerase activities. PPARγ contributes to the development of phagocytic capacity of macrophages by inducing specific phagocytic genes. The PPARγ, rretinoid and LXR receptor signal pathways are interlinked in regulating cholesterol content of cells. Activation of PPARγ in dendritic cells leads to the development of a subpopulation with increased phagocytic capacity, effective lipid presentation and iNKT activity. An apopto-phagocytic Taqman Low Density array has been developed for quantitative measuring of 94 genes in parallel. Cells dying by autophagy are removed by the same mechanism as apoptotic cells while specific phagocytic genes are induced. Dendritic cells interacting with apoptotic cells can fine tune the immune system

Kationcsatorna-gátló toxinok hatása mitogénnel stimulált T-limfocitákra

Az előadás a Biokémia, Mikrobiológia, Immunológia szekcióban első helyezett lett.Tanulmányi rendszerbe betöltv

Limfociták proliferációjának és Kv1.3 kálium ioncsatornáinak vizsgálata hiperkoleszterinémiás állapotban

Konzervatív Klinikai Orvostudomány I. szekcióban ezzel az előadással I. díjat nyertemTanulmányi rendszerbe betöltv