Characterization of ampicillin resistance mechanisms in clinical Haemophilus influenzae strains isolated in Portugal between 2009 and 2012

Introduction: Haemophilus influenzae (Hi) is mainly responsible for respiratory infections and empirical therapy is used most of times. Ampicillin resistance is a problem of concern since some strains have diminished susceptibility to β-lactams through a non-enzymatic mechanism that involves decreased affinity of β-lactams for altered penicillin-binding proteins (PBPs). Strains exhibiting this resistance mechanism are referred as β-lactamase-negative ampicillin resistant (BLNAR). The aim of this study is to characterize ampicillin resistance mechanisms in clinical isolates of Hi in Portugal. Material and Methods: Two hundred and thirty-five isolates chosen according to their ampicillin MICs: 139 BLNAR (MIC≥1mg/L), 33 susceptible strains (BLNAS; MIC<1mg/L) and 63 β-lactamase producers (BLPAR) were analyzed. The ftsI gene encoding PBP3 was amplified and sequenced. MIC was determined for 13 antibiotics by a microdilution assay, according to CLSI guidelines. Results and Discussion: Of the 235 Hi isolates 199 had mutations in the ftsI transpeptidase domain as follow: 136 gBLNAR out of 139 BLNAR strains (98%) and 44 gBLPACR out of 63 BPLAR strains (70%). Of note, 19 out of 33 BLNAS (58%) presented mutations being designated as gBLNAR. Among gBLNAR and gBLPACR strains there were 43 different mutation patterns, that were included in the six previously described groups and subgroups (I, IIa, IIb, IIc, IId, III-like). The most common amino acid substitutions were located near KTG motif: N526K (160/199, 80.4%), V547I (140/199, 70.4%) and N569S (131/199, 65.8%). Strains with mutations were less susceptible to the β-lactam antibiotics studied. Comparing these results with previously ones, performed in our laboratory (between 2001 and 2008) we are assisting to an increase of susceptible strains (ampicillin MIC≤2mg/L) as well as resistant strains (beta-lactamase producers) with mutations in the ftsI gene, being so called gBLNAR and gBLPACR. CLSI breakpoints alone can’t characterize these strains as susceptible or resistant in the susceptibility tests performed routinely in the laboratory. In this way, a continuous research on breakpoints and methodologies to better define strains of this kind is of crucial importance. In conclusion, we emphasize the importance of continuing surveillance studies of this nature as essential tools to define trends in the antibiotic resistance of Hi

Alteração à epidemiologia da Infeção a Haemophilus influenzae, após a introdução da vacina para o H. influenzae serotipo b. Análise de estudos realizados no INSA, 1989-2012

Resumo: O Haemophilus influenzae (H. influenzae) é um microrganismo Gram negativo cujo nicho ecológico é o trato respiratório humano. Para além de colonizar a nasofaringe de pessoas saudáveis, o H. influenzae é normalmente responsável por infeções respiratórias e ainda infeções invasivas graves como a meningite e a septicemia, principalmente nas crianças (Tristram, 2007). As estirpes capsuladas, nomeadamente as de serotipo b (Hib) eram, até à introdução da vacina conjugada, responsáveis pela maior parte dos casos de infeção invasiva (Peltola, 2000). A vacina para o Hib foi licenciada em Portugal em 1994 e incluída no Programa Nacional de Vacinação (PNV) no ano 2000, para crianças até aos 5 anos de idade. Como consequência, as infeções invasivas de serotipo b foram praticamente eliminadas nas populações onde a vacina foi implementada (Wenger, 1998). No entanto, esta vacina não protege contra a infeção invasiva por estirpes não capsuladas (NC) ou de serotipos não b sendo, de momento, as estirpes NC as responsáveis pela maior parte destas infeções (Ladhani et al., 2010; Ulanova & Tsang, 2009). Desde 1989 que, primeiro no Laboratório de Resistência aos Antibióticos e, mais recentemente, no Laboratório Nacional de Referência de Infeções Respiratórias a agentes bacterianos, se têm realizado estudos em infeções por Haemophilus influenzae, nas várias vertentes, de vigilância epidemiológica, referência e investigação. Até ao momento contamos com uma coleção de isolados clínicos de mais de 12000 estirpes, isoladas de todas as infeções e de todas as idades, de vários Hospitais geograficamente distribuídos em Portugal. Colaboramos com a Sociedade Portuguesa de Pediatria, no que se refere à infeção invasiva na criança. Relativamente a projetos de investigação temos colaborado com alguns laboratórios de investigação, em Portugal e no Estrangeiro. É diversa a metodologia utilizada para estudar este microrganismo, recorrendo-se a diferentes técnicas para cada tipo de estudo, que vão desde técnicas fenotípicas para determinar a susceptibilidade aos antibióticos até técnicas de biologia molecular, como PCR e sequenciação para estudos genotípicos. Para além destas, e com o objetivo de estudar a clonalidade e disseminação das estirpes, utilizamos ainda duas técnicas de tipagem molecular: Pulsed-Field-Gel-Electrophoresis (PFGE) (Campos et al., 2004) e Multilocus Sequencing Type (MLST) (Meats et al, 2003). Serão apresentados resultados de alguns estudos, tanto de vigilância epidemiológica, como de investigação, realizados no nosso laboratório, e que demonstram a alteração na epidemiologia da infeção a H. influenzae após a introdução da vacina, em Portugal (Bajanca et al, 2004; Barbosa et al, 2011; Calado et al, 2011)   Referências Bibliográficas: • Bajanca P, Caniça M, & the Multicenter Study Group. J Clin Microbiol 2004; 42:807-10. • Barbosa R, Giufrè M, Cerquetti M, & Bajanca-Lavado, P. J Antimicrob Chemother 2011; 66:788-96. • Calado R, Betencourt C, Gonçalves H, Cristino N, Calhau P & Bajanca-Lavado, P. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 69:111-13. • Campos J, Hernando M, Román F, Pérez-Vazquez M, Aracil B, Oteo J et al, J Clin Microbiol 2004; 42:524-9. • Ladhani S, Slack M, Heath P, von Gottberg A, Chandra M. Ramsay M & EUIBIS participants. Emerg Infect Dis 2010; 16:455-63. • Peltola H. Clin Microbiol Rev 2000; 13:302-17. • Tristam S, Jacobs M & Appelbaum P. Clin Microbiol Rev 2007; 20:368-89. • Ulanova M, Tsang R. Infect Genet Evol 2009; 9:594-605. • Wenger D. Pediatrr Infect Dis J 1998; 17 (Suppl.9):S132-36. • Meats E, Feil EJ, Stringer S, Cody AJ, Goldstein R, Kroll JS, et al, J Clin Microbiol 2003; 41: 1623-1636

Multilocus Sequencing Typing of Invasive Haemophilus influenzae strains Isolated in Portugal in the Pre-vaccination Period (1989-2001)

Introduction: Haemophilus influenzae can cause life-threatening infections in children and adults, such as pneumonia, bacteremia, and meningitis, despite de availability of the H. influenzae type b vaccine. Six capsular types, a-f, have been identified to date. Non-capsulated (NC) H. influenzae have also been described. Multilocus Sequencing Typing (MLST) is a powerful method that allows a precise and unambiguous characterization of H. influenzae genotypes. Aim: Identification of the major genotypes that characterize Portuguese invasive H. influenzae strains in the years before the implementation of the Hib vaccine (1989-2001). Comparison of results from this study with the ones from our previous published study with isolates from pos-vaccination period (2002-2010). Methods: Seventy invasive H. influenzae strains (38 Hib, 31 NC, 1 f) were randomly selected for analysis, isolated during 1989-2001 from cerebrospinal fluid (n=24), blood (n=43) and pleural fluid (n=3). Thirty-six strains (51.4%) were isolated from pre-school children. Capsular status was identified by PCR amplification of bexA gene and capsular type was determined by amplification of capsule-specific genes (for serotypes a-f) using primers and conditions described in the literature. MLST was performed by sequencing internal fragments of the 7 housekeeping genes (adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi and recA). Sequences were analyzed and submitted to the MLST website (http://haemophilus.mlst.net) for assignment of the sequence type (ST). Phylogenetic estimations were conducted through MEGA5 by using the neighbor-joining method. Results: Thirty-four (89.5%) of the 38 Hib isolates analyzed were assigned to CC6, 4 of which were new STs, while 4 were single strains of different STs. Of the 31 NC isolates, 26 (83.9%) were single strains of different STs (12 new STs), 4 strains belong to CC395 and CC396 (2 strains each), and 1 was identified as CC6. The isolate type f was characterized as ST124. Discussion and conclusions: In this study we observed a high diversity of NC strains, in opposite to Hib clonality. Despite of the great decline of serotype b in the pos-vaccination period, with a concomitant increase of NC and non–b isolates, no significant differences were observed in the MLST characterization of pre-vaccination isolates. Of the 16 Hib studied, all but one were characterized as CC6 (94.7%). Among the 67 NC isolates, 42 (62.7%) were single strains of different STs; the remaining isolates were of 6 different CCs. In conclusion, there are no differences in molecular typing of H. influenzae strains isolated in the pre and pos-vaccination period, in our country. The majority of episodes of invasive disease occurring in Portugal are now due to fully susceptible, highly diverse, non-capsulated strains. Given the evolving dynamics of this pathogen and the increase in non-type b capsulated isolates, continuous surveillance is needed

Haemophilus influenzae Carriage among Healthy Children in Portugal, 2015-2019

This article belongs to the Special Issue Haemophilus influenzae: New Insights in Epidemiology of Disease.Haemophilus influenzae is an important cause of mucosal and invasive infections and a common colonizer of the upper respiratory tract. As there are no recent data on H. influenzae carriage in Portugal, we aimed to characterize carriage samples and investigate possible parallelisms with disease isolates. Between 2016–2019, 1524 nasopharyngeal samples were obtained from children (0–6 years) attending day-care. H. influenzae were serotyped and screened for β-lactamase production. Strains producing β-lactamase and/or those that were encapsulated were further characterized by antibiotype; encapsulated strains were also investigated for MLST and the presence of antimicrobial resistance and virulence genes (extracted from whole genome sequencing). The overall carriage rate was 84.1%. Most isolates (96.7%) were nonencapsulated. Encapsulated strains were of serotypes f (1.8%), e (1.1%), a (0.3%), and b (0.1%). MLST showed clonality within serotypes. Although the lineages were the same as those that were described among disease isolates, colonization isolates had fewer virulence determinants. Overall, 7.5% of the isolates were β-lactamase positive; one isolate had blaTEM-82, which has not been previously described in H. influenzae. A single isolate, which was identified as H. parainfluenzae, had an incomplete f-like cap locus. In conclusion, circulation of serotype b is residual. The few encapsulated strains are genetically related to disease-causing isolates. Thus, surveillance of H. influenzae carriage should be maintained.This work was partially supported by projects LISBOA-01-0145-FEDER (Microbiologia Molecular, Estrutural e Celular, funded by FEDER through COMPETE2020—Programa Operacional Competitividade e Internacionalização), LISBOA-01-0145-FEDER-016417 (ONEIDA co-funded by Fundos Europeus Estruturais e de Investimento, Programa Operacional Regional Lisboa 2020 and Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)), WI230921 from Pfizer Portugal (to RSL), and National Institute of Health, Lisbon, Portugal. CC was supported by grant from Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Portugal.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Spatial and temporal genomic homogeneity among Haemophilus influenzae serotype f

Background: Haemophilus influenzae is an opportunistic pathogen highly adapted to the human respiratory tract which is often reported as the etiologic agent of infectious diseases. After the introduction of serotype b vaccine, non-typeable H. influenzae (NTHi) has become the most frequent cause of respiratory infection, followed in frequency by serotype f strains (Hif). The aim of this study was to analyze the genomic diversity among invasive and colonizing Hif isolates by whole genome sequencing (WGS).N/

Multilocus sequencing typing as a tool to investigate childhood Haemophilus influenzae invasive disease in Portugal

Background: Haemophilus influenzae is an important cause of serious childhood invasive disease despite the use of the vaccine against serotype b strains (Hib). Six capsular types, a-f, have been identified to date, although most of strains are non-capsulated (NC). Multilocus Sequencing Typing (MLST) is a powerful method that allows a precise and unambiguous characterization of H. influenzae genotypes. A partnership between the National Institute of Health and the Society for Paediatric Infectious Diseases aimed to characterize invasive childhood infection in Portugal. The objective of this study was to genotype isolates by MLST to follow the epidemiology of disease. Material / Methods: This study was conducted between 1 January 2010 and 31 December 2015. During this period 41 H. influenzae strains were analysed, mostly isolated from blood (88%). Antibiotic resistance was assessed by the microdilution assay and β-lactamase production was determined with nitrocefin. Capsular status was characterized by polymerase chain reaction using primers and conditions described in the literature. MLST was performed by amplifying and sequencing internal fragments of the 7 housekeeping genes (adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi and recA). Sequences were analyzed and submitted to the MLST website http://pubmlst.org/hinfluenzae/ for assignment of the sequence type (ST). To display the allelic distances between the obtained STs, we applied the goeBURST algorithm implemented in the PHYLOViZ platform. Results: Antimicrobial susceptibility testing showed that most strains were susceptible to all beta-lactams studied, with only three strains being ampicillin resistant due to beta-lactamase production. Most of invasive disease was due to the presence of NC strains (27/41; 66%), while 14 isolates (34%) were capsulated and characterized as follow: two serotype a (5%), 10 b (24%) and two f (5%). As expected, MLST typing revealed high genetic variability among 27 NC isolates, which had 24 (89%) different sequence types (STs), with four new STs represented by previously unidentified allele combinations. In opposition, capsulated isolates were very clonal: all 10 Hib were assigned to CC6 (eight strains ST6, one ST 1149, one ST 190), the two Hia strains were assigned to CC 23 (ST 23) and the two Hif belonged to CC124 (ST 124 and ST 1188) (Figure 1). Conclusions: Our data indicate that invasive disease among Portuguese children is now due to highly genetically diverse, fully susceptible NC strains, suggesting that no particular virulent clone is responsible for epidemiological change of disease, after vaccine implementation in the year 2000. Nevertheless, we are concerned about Hib disease (24% of the isolates) despite the higher vaccine coverage. MLST typing continues to show a high genetic diversity among NC strains and clonal relationships among capsulated isolates. In conclusion, in order to monitor the evolving dynamics of this pathogen and the epidemiology of invasive disease, ongoing surveillance is needed to monitor the true magnitude of this problem.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

SARS-CoV-2 introductions and early dynamics of the epidemic in Portugal

Genomic surveillance of SARS-CoV-2 in Portugal was rapidly implemented by the National Institute of Health in the early stages of the COVID-19 epidemic, in collaboration with more than 50 laboratories distributed nationwide. Methods By applying recent phylodynamic models that allow integration of individual-based travel history, we reconstructed and characterized the spatio-temporal dynamics of SARSCoV-2 introductions and early dissemination in Portugal. Results We detected at least 277 independent SARS-CoV-2 introductions, mostly from European countries (namely the United Kingdom, Spain, France, Italy, and Switzerland), which were consistent with the countries with the highest connectivity with Portugal. Although most introductions were estimated to have occurred during early March 2020, it is likely that SARS-CoV-2 was silently circulating in Portugal throughout February, before the first cases were confirmed. Conclusions Here we conclude that the earlier implementation of measures could have minimized the number of introductions and subsequent virus expansion in Portugal. This study lays the foundation for genomic epidemiology of SARS-CoV-2 in Portugal, and highlights the need for systematic and geographically-representative genomic surveillance.We gratefully acknowledge to Sara Hill and Nuno Faria (University of Oxford) and Joshua Quick and Nick Loman (University of Birmingham) for kindly providing us with the initial sets of Artic Network primers for NGS; Rafael Mamede (MRamirez team, IMM, Lisbon) for developing and sharing a bioinformatics script for sequence curation (https://github.com/rfm-targa/BioinfUtils); Philippe Lemey (KU Leuven) for providing guidance on the implementation of the phylodynamic models; Joshua L. Cherry (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health) for providing guidance with the subsampling strategies; and all authors, originating and submitting laboratories who have contributed genome data on GISAID (https://www.gisaid.org/) on which part of this research is based. The opinions expressed in this article are those of the authors and do not reflect the view of the National Institutes of Health, the Department of Health and Human Services, or the United States government. This study is co-funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia and Agência de Investigação Clínica e Inovação Biomédica (234_596874175) on behalf of the Research 4 COVID-19 call. Some infrastructural resources used in this study come from the GenomePT project (POCI-01-0145-FEDER-022184), supported by COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Lisboa Portugal Regional Operational Programme (Lisboa2020), Algarve Portugal Regional Operational Programme (CRESC Algarve2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF), and by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Infeção invasiva a Haemophilus influenzae na criança

Comunicação oral apresentada por convite.INTRODUÇÃO: O Haemophilus influenzae (H. influenzae) é um microrganismo Gram negativo cujo nicho ecológico é o trato respiratório humano. Para além de colonizar a nasofaringe de pessoas saudáveis, o H. influenzae é normalmente responsável por infeções respiratórias e ainda infeções invasivas graves como a meningite e a septicemia, principalmente nas crianças As estirpes responsáveis por infeções invasivas possuem cápsula (designadas de a-f), ao contrário da maior parte das estirpes isoladas de outras infeções ou de pessoas saudáveis. As estirpes capsuladas, nomeadamente as de serotipo b (Hib) eram, até à introdução da vacina conjugada, responsáveis pela maior parte dos casos de infeção invasiva. A vacina para o Hib foi licenciada em Portugal em 1994 e incluída no Programa Nacional de Vacinação (PNV) no ano 2000, para crianças até aos 5 anos de idade. Como consequência, as infeções invasivas de serotipo b foram praticamente eliminadas nas populações onde a vacina foi implementada. OBJETIVO: Caracterizar 48 estirpes invasivas isoladas de crianças (idade igual ou inferior a 18 anos), que foram colecionadas no DDI, INSA, de diversos Hospitais em Portugal, no período após a introdução da vacina (2002-2010) e comparar com os resultados obtidos de 64 estirpes isoladas de crianças no período pré-vacinal (1989-2001). METODOLOGIA: A produção de β-lactamase foi pesquisada pelo método colorimétrico, utilizando nitrocefin como substrato. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM, mg/L) foi realizada pelo método de microdiluição em placa para 13 antibióticos (ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefaclor, cefuroxima, ceftriaxone, cefepime, meropenem, cloranfenicol, tetraciclina, rifampicina, trimetoprim/sulfametoxasol, ciprofloxacina e azitromicina); os “breakpoints” utilizados foram os estabelecidos pelo CLSI. Foi efetuada a pesquisa de cápsula e caracterizado o serotipo capsular por “Polymerase Chain Reaction”. RESULTADOS: As estirpes estudadas foram isoladas dos seguintes produtos biológicos: hemocultura (30), líquido cefaloraquidiano (15) e líquido pleural (3). Trinta e tês estirpes (68,8%) foram caracterizadas como não capsuladas (NC), 9 de serotipo b (18,8%), 1 de serotipo a (2%), 1 de serotipo d (2%) e 4 de serotipo f (8,3%). A produção de β-lactamase foi caraterizada em 6 estirpes (12,5%). Nas estirpes não produtoras de β-lactamase detetaram-se 3 estirpes (7,1%) com o fenótipo de resistência BLNAR (β-lactamase negativa e ampicilina resistente); estas estirpes caraterizam-se pela diminuição de afinidade aos antibióticos β-lactâmicos, devido a mutações no gene ftsI, que codifica a PBP3. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES: Os dados apresentados, quando comparados com os do período pré-vacinal demonstram uma alteração na epidemiologia da infeção nas crianças; assim as estirpes NC passaram de 34 a 68,8% verificando-se um grande aumento de estirpes NC responsáveis pela infeção invasiva. Pode-se, assim, deduzir que as estirpes NC poderão ter adquirido maior virulência. Pelo contrário e como esperado, observamos um grande declínio das estirpes serotipo b: de 65,6 para 18,8%, o que é de facto um visível efeito da introdução da vacina no nosso país. O serotipo a e f, só foi caracterizado no período pós-vacinal. Não se observam estirpes de serotipo c nem e na infeção invasiva em Portugal e até ao momento. A estirpe de serotipo d foi pela primeira vez caracterizada em 2009 num latente com meningite, não sendo conhecido até então qualquer caso de uma infeção invasiva por H. influenzae serotipo d na Europa. Em relação à susceptibilidade aos antibióticos, nomeadamente à ampicilina, observamos um decréscimo da produção de enzima beta-lactamase: de 30 para 12,5%. As estirpes BLNAR só foram detetadas no período pós-vacinal com uma percentagem já elevada: 7,1%. Com estes resultados observa-se uma alteração no mecanismo de resistência à ampicilina, com a diminuição do mecanismo enzimático e a deteção de estirpes com resistência não enzimática. A multirresistência (resistência a 3 ou mais antibióticos) foi observada pela última vez em 1994, em estirpes de serotipo b; com o declínio deste serotipo diminuiu também a resistência aos antibióticos no geral e da multirresistência em particular. Podemos concluir que as infeções invasivas a Hib foram praticamente eliminadas nas populações onde a vacina foi implementada. No entanto, esta vacina não protege contra a infeção invasiva por estirpes NC ou de serotipos não-b, o que demonstra a importância de continuar a vigilância da infeção invasiva a H. influenzae

Vigilância laboratorial e epidemiológica da infeção a Haemophilus influenzae, após a introdução da vacina para o H. influenzae serotipo b no Programa Nacional de Vacinação: apresentação de estudos realizados no INSA, 1989-2013

O Haemophilus influenzae (H. influenzae) é um microrganismo Gram negativo cujo nicho ecológico é o trato respiratório humano. Enquanto a maior parte da população de H. influenzae existe como agente colonizador da nasofaringe, ainda continua a ser, globalmente, um patogénico com significado na clínica. É responsável por tanto por infeções localizadas das mucosas, como é o caso da otite média, ou da conjuntivite, e ainda por infeções invasivas graves como a meningite e a septicemia, principalmente nas crianças (Turk, 1984; Tristram, 2007). A presença ou ausência de cápsula tem sido associada à maior ou menor virulência das estirpes. As estirpes responsáveis por infeções invasivas possuem cápsula, ao contrário da maior parte das estirpes isoladas de outras infeções ou de pessoas saudáveis. Estas estirpes foram agrupadas em seis serotipos, designados de a-f. As estirpes capsuladas, nomeadamente as de serotipo b (Hib) eram, até à introdução da vacina conjugada, responsáveis pela maior parte dos casos de infeção invasiva (Peltola, 2000). A vacina para o Hib, licenciada em Portugal em 1994 e incluída no Programa Nacional de Vacinação (PNV) no ano 2000 para administração a crianças até aos 5 anos de idade, resultou na eliminação da quase totalidade das infeções invasivas por este serotipo nas populações onde a vacinação foi implementada (Wenger, 1998; Bajanca et al., 2004). Contudo, esta vacina não protege contra a infeção invasiva por estirpes não capsuladas (NC) ou de serotipos não b sendo, atualmente, as estirpes NC as responsáveis pela maior parte destas infeções (Ladhani et al., 2010; Ulanova & Tsang, 2009). A vacinação tem também impacto na ecologia da colonização do trato respiratório, assim como nos perfis de resistência aos antibióticos. Desde 1989 que, primeiro no Laboratório de Resistência aos Antibióticos e, mais recentemente, no Laboratório Nacional de Referência de Infeções Respiratórias a agentes bacterianos, se têm realizado estudos em infeções por H. influenzae, nas várias vertentes, desde a vigilância epidemiológica, à referência e investigação. Até ao momento contamos com uma coleção de quase 13000 isolados clínicos. As estirpes têm sido isoladas de pacientes de qualquer idade e com todo o tipo de infeção, de vários Hospitais geograficamente distribuídos em Portugal. A infeção invasiva, por ser a mais grave é a que mais nos tem preocupado. Relativamente a esta infeção nas crianças colaboramos com a Sociedade Portuguesa de Pediatria, de modo a que nos sejam enviadas as estirpes responsáveis por todos os casos, acompanhadas de dados clínicos. Os estudos de investigação são realizados com as estirpes da nossa coleção e, nesta área, colaboramos com Laboratórios de Investigação a nível Nacional e Internacional. A metodologia utilizada para estudar este microrganismo, é diversificada, passando desde técnicas fenotípicas para caraterizar as estirpes ou estudar a susceptibilidade aos antibióticos, até técnicas de biologia molecular, para estudos genotípicos. Para além destas, e com o objetivo de estudar a clonalidade e disseminação das estirpes, utilizamos ainda duas técnicas de tipagem molecular: Pulsed-Field-Gel-Electrophoresis (PFGE) (Campos et al., 2004) e Multilocus Sequencing Type (MLST) (Meats et al, 2003). Nesta palestra pretende-se apresentar resultados de alguns estudos, tanto de vigilância epidemiológica, como de investigação, que se têm realizado no nosso laboratório, e que demonstram a alteração na epidemiologia da infeção a H. influenzae após a introdução da vacina, em Portugal (Bajanca et al, 2004; Barbosa et al, 2011; Calado et al, 2011). Referências Bibliográficas: - Bajanca P, Caniça M, & the Multicenter Study Group. J Clin Microbiol 2004; 42:807-10. - Barbosa R, Giufrè M, Cerquetti M, & Bajanca-Lavado, P. J Antimicrob Chemother 2011; 66:788-96. - Calado R, Betencourt C, Gonçalves H, Cristino N, Calhau P & Bajanca-Lavado, P. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 69:111-13. - Campos J, Hernando M, Román F, Pérez-Vazquez M, Aracil B, Oteo J et al, J Clin Microbiol 2004; 42:524-9. - Ladhani S, Slack M, Heath P, von Gottberg A, Chandra M. Ramsay M & EUIBIS participants. Emerg Infect Dis 2010; 16:455-63. - Meats E, Feil EJ, Stringer S, Cody AJ, Goldstein R, Kroll JS, et al, J Clin Microbiol 2003; 41: 1623-1636. - Peltola H. Clin Microbiol Rev 2000; 13:302-17. - Tristam S, Jacobs M & Appelbaum P. Clin Microbiol Rev 2007; 20:368-89. - Turk, D. J Med Microbiol; 1984; 18:1-16. - Ulanova M, Tsang R. Infect Genet Evol 2009; 9:594-605. - Wenger D. Pediatrr Infect Dis J 1998; 17 (Suppl.9):S132-36