Estudio de la translocación al hospedador de los efectores PIPB2 y SSEK1 de salmonella enterica serovar typhimurium y análisis genético de SSEK1

Salmonella enterica es una especie de bacteria patógena Gram negativa responsable de diversas enfermedades en animales como la gastroenteritis y la fiebre tifoidea. S. enterica expresa dos sistemas de secreción tipo III (T3SSs) relacionados con la virulencia codificados en las islas de patogenicidad de Salmonella 1 (SPI1) y SPI2, respectivamente. Varias proteínas efectoras, que son secretadas a través de estos sistemas hacia las células hospedadoras eucariotas, interfieren con determinadas vías de transducción de señales para hacer posible la internalización del patógeno y su supervivencia y proliferación en vacuolas. PipB2 y SseK1 son dos de los efectores translocados por estos sistemas de secreción. En la primera parte de la tesis se generaron, en el genoma de Salmonella, fusiones traduccionales con la adenilato ciclasa CyaA de Bordetella pertussis como herramientas para el estudio de la translocación de efectores de Salmonella hacia el citosol de células de mamífero. El análisis de fusiones aleatorias ha revelado que PipB2 puede translocarse, no sólo a través del T3SS codificado en la SPI2 como estaba descrito, sino también a través del codificado en la SPI1. Esta translocación se ha observado en células epiteliales, en macrófagos y en fibroblastos y requiere los primeros 10 aminoácidos de la proteína. El resto del trabajó se centró en el estudio del efector SseK1. Mostramos que SseK1 es un factor de virulencia en ratones aunque no es necesario para la invasión ni la proliferación intracelular en cultivos de células de mamífero. La expresión de sseK1 resultó ser superior en condiciones de inducción de la SPI2 pero fue también significativa en condiciones de inducción de la SPI1. La translocación de SseK1 a células hospedadoras ocurre por ambos T3SS aunque con diferentes patrones y cinéticas dependiendo del tipo celular. El sistema de dos componentes PhoQ/PhoP regula positivamente a sseK1 gracias a la unión directa de PhoP a la región promotora de este gen. Por último hemos realizado un estudio preliminar de los posibles efectos biológicos del efector SseK1 en la célula hospedadora mediante dos tipos de análisis: (i) Un escrutinio con el sistema del doble híbrido en levaduras para encontrar proteínas de la célula hospedadora capaces de interaccionar con SseK1. (ii) Un análisis transcriptómico de células epiteliales humanas HeLa para conocer los efectos de la expresión estable de SseK1 mediante transfección y de su translocación durante una infección con S. enterica serovar Typhimurium

Host cell type-dependent translocation and PhoP-mediated positive regulation of the effector SseK1 of Salmonella enterica.

Salmonella enterica expresses two virulence-related type III secretion systems (T3SSs) encoded in Salmonella pathogenicity island 1 (SPI1) and SPI2, respectively. SseK1 is a poorly characterized substrate of the SPI2-encoded T3SS. Here, we show that this effector is essential to get full virulence both in oral and intraperitoneal mice infections, in spite of not having a role in invasion or intracellular proliferation in cultured mammalian cells. In vitro, expression of sseK1 was higher in media mimicking intracellular conditions, when SPI2 was induced, but it was also significant under SPI1 inducing conditions. A detailed analysis of translocation of SseK1 into host cells unveiled that it was a substrate of both, T3SS1 and T3SS2, although with different patterns and kinetics depending on the specific host cell type (epithelial, macrophages, or fibroblasts). The regulation of the expression of sseK1 was examined using lacZ and bioluminescent lux fusions. The two-component system PhoQ/PhoP is a positive regulator of this gene. A combination of sequence analysis, directed mutagenesis and electrophoretic mobility shift assays showed that phosphorylated PhoP binds directly to the promoter region of sseK1 and revealed a PhoP binding site located upstream of the predicted -35 hexamer of this promoter

Tubulin Folding Cofactor TBCB is a Target of the Salmonella Effector Protein SseK1

Salmonella enterica serovar Typhimurium is a human and animal pathogen that uses type III secretion system effectors to manipulate the host cell and fulfill infection. SseK1 is a Salmonella effector with glycosyltransferase activity. We carried out a yeast two-hybrid screen and have identified tubulin-binding cofactor B (TBCB) as a new binding partner for this effector. SseK1 catalyzed the addition of N-acetylglucosamine to arginine on TBCB, and its expression promoted the stabilization of the microtubule cytoskeleton of HEK293T cells. The conserved Asp-x-Asp (DxD) motif that is essential for the activity of SseK1 was required for the binding and modification of TBCB and for the effect on the cytoskeleton. Our study has identified a novel target for SseK1 and suggests that this effector may have a role in the manipulation of the host cell microtubule network to provide a safe niche for this pathogen.España Ministerio de Economía, Industria y Competitividad – Agencia Estatal de Investigación, and the European Regional Development Fund, grant number SAF2016-75365-R;European Union’s Horizon 2020 grant agreement No 842629

Estudio de la expresión de genes de Salmonella enterica y su efecto en la interacción con plantas.

Salmonella enterica es una bacteria patógena Gram negativas que causa enfermedades como la gastroenteritis o la fiebre tifoidea en diversos animales. Para desarrollar el proceso infeccioso en animales S. enterica se sirve de dos sistemas de secreción de tipo 3 (T3SS-1 y T3SS-2) los cuales inyectan al interior de la célula hospedadora una serie de proteínas de virulencia conocidas como efectores. Además de los T3SSs y los efectores que translocan, existen otras proteínas que intervienen en los procesos de virulencia como son las adhesinas y las fimbrias, encargadas del reconocimiento y adhesión a la célula hospedadora, así como la metilasa Dam, la cual regula la expresión de muchos de los factores de virulencia al metilar motivos GATC en los promotores. De la mayoría se estos factores se ha observado que presentan heterogeneidad fenotípica, formando poblaciones biestables en los que una parte de la población está expresando un determinado gen mientras que otra parte de población no lo está expresando. Recientemente se ha observado la capacidad de S. enterica de colonizar plantas y que en este proceso podrían estar implicados los mismos factores que son responsables de la virulencia en animales, que podrían presentar también heterogeneidad fenotípica. En el presente trabajo nos hemos propuesto estudiar tanto la heterogeneidad fenotípica de diversos genes de S. enterica implicados en su interacción con plantas, como el efecto que estos genes pueden tener en dicha interacción. Para ello nos servimos tanto de fusiones transcripcionales a fluoróforos como de mutantes nulos en los genes de interés, que serán estudiados en los medios LB, TM (extracto de hoja de tomate) y HIM (medio que emula las condiciones del apoplasto de las hojas de plantas) así como en plantas de tomate (crecimiento en la superficie de la hoja y posible formación de biofilm) y Arabidopsis (crecimiento en apoplasto).Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Novel Template Plasmids pCyaA’-Kan and pCyaA’-Cam for Generation of Unmarked Chromosomal cyaA’ Translational Fusion to T3SS Effectors in Salmonella

The type III secretion systems (T3SS) encoded in pathogenicity islands SPI-1 and SPI-2 are key virulence factors of Salmonella. These systems translocate proteins known as effectors into eukaryotic cells during infection. To characterize the functionality of T3SS effectors, gene fusions to the CyaA’ reporter of Bordetella pertussis are often used. CyaA’ is a calmodulin-dependent adenylate cyclase that is only active within eukaryotic cells. Thus, the translocation of an effector fused to CyaA’ can be evaluated by measuring cAMP levels in infected cells. Here, we report the construction of plasmids pCyaA’-Kan and pCyaA’-Cam, which contain the ORF encoding CyaA’ adjacent to a cassette that confers resistance to kanamycin or chloramphenicol, respectively, flanked by Flp recombinase target (FRT) sites. A PCR product from pCyaA’-Kan or pCyaA’-Cam containing these genetic elements can be introduced into the bacterial chromosome to generate gene fusions by homologous recombination using the Red recombination system from bacteriophage λ. Subsequently, the resistance cassette can be removed by recombination between the FRT sites using the Flp recombinase. As a proof of concept, the plasmids pCyaA’-Kan and pCyaA’-Cam were used to generate unmarked chromosomal fusions of 10 T3SS effectors to CyaA’ in S. Typhimurium. Each fusion protein was detected by Western blot using an anti-CyaA’ monoclonal antibody when the corresponding mutant strain was grown under conditions that induce the expression of the native gene. In addition, T3SS-1-dependent secretion of fusion protein SipA-CyaA’ during in vitro growth was verified by Western blot analysis of culture supernatants. Finally, efficient translocation of SipA-CyaA’ into HeLa cells was evidenced by increased intracellular cAMP levels at different times of infection. Therefore, the plasmids pCyaA’-Kan and pCyaA’-Cam can be used to generate unmarked chromosomal cyaA’ translational fusion to study regulated expression, secretion and translocation of Salmonella T3SS effectors into eukaryotic cells