Retrovirális proteinázok vizsgálata a rezisztencia kialakulásának megértéséhez, és felhasználásuk biológiai folyamatok szabályozására = Study of retroviral proteinases to understand development of resistance and their use in regulation of biological processes

Számos, gyógyszerrezisztenciában megjelenő mutációt tartalmazó HIV-1 proteináz specificitását, gátolhatósági profilját és dimerstabilitását jellemeztük. A gátolhatósági profilok elkészítéséhez nagykapacitású floreszcens mérési módszert dolgoztunk ki. Eredményeink arra utaltak, hogy a mutánsok gátolhatóságát jelentősen befolyásolta a ligandok konformációs flexibilitása, továbbá az enzim egyik régiója képes volt mutációktól függetlenül a ligandhoz illeszkedni. Cefalosporin származékokat tartalmazó vegyületkönyvtár szűrésével különleges, unkompetitív mechanizmusú HIV-1 proteináz inhibitorokat azonosítottunk. A HIV-1 fertőzés korai szakaszában szubsztrátként valószínűsített nukleokapszid fehérje hasításával kapcsolatban szubsztrát-mutagenezis és kinetikai vizsgálatokat végeztünk és a mutációkat a HIV vírusba bejuttatva korrelációt tapasztaltunk a fertőzőképesség és a nukleokapszid fehérje proteolitikus érzékenysége között. Különböző retrovírusok természetes hasítási helyeit reprezentáló oligopeptidekkel összehasonlítottuk retrovirális proteinázok specificitását, mely alapján a HTLV-1 proteáz szubsztrátspecificitása meglehetősen szűknek bizonyult. Egy HIV-1 természetes hasítási helyet reprezentáló oligopeptid sorozattal végzett korábbi szubsztrátspecificitási vizsgálatainkat részben kiegészítettük úgy, hogy az adatsor már 11 retrovirális proteáz adatait tartalmazza. Egy alhely feltérképezésével kapott eredményeink jól korreláltak a retrovírusok filogenetikai analízisével. | Specificity, dimer stability and inhibition profile was determined for several HIV-1 protease mutants harboring mutations occurring in drug resistance. To perform the inhibition profiling, a new, high-throughput fluorescent assay was developed. Our results suggested that the inhibition of the mutants was stronlgy dependent on the conformational flexibility of the inhibitors, furthermore, a critical region of the enzyme was able to fit flexibly to the ligands, independently from its mutations. Screening a library of cephalosporin derivatives, inhibitors uniqally acting in an uncompetitive manner were identified. Mutational and kinetic studies were performed on the nucleocapsid protein, which is suspected to be a substrate of the viral protease in the early phase of infection, and mutations were introduced into an infectious HIV-1 clone. There was a correlation between the protease sensitivity of mutant nucleocapsid proteins and the infectivity of the clones. The specificity of various retroviral proteinases was compared using a large set of oligopeptide substrates representing naturally occurring cleavage sites of various retroviruses: the specificity of HTLV-1 protease appeared to be fairly narrow. We have complemented our previous specificity studies performed with a substrate set representing an HIV-1 cleavage site to probe a substrate binding subsite of 11 retroviral proteases. The results obtained correlated well with the philogenetic analysis of retroviruses

A molecular model of the full-length human NOD-like receptor family CARD domain containing 5 (NLRC5) protein

BACKGROUND: Pattern recognition receptors of the immune system have key roles in the regulation of pathways after the recognition of microbial- and danger-associated molecular patterns in vertebrates. Members of NOD-like receptor (NLR) family typically function intracellularly. The NOD-like receptor family CARD domain containing 5 (NLRC5) is the largest member of this family that also contains the largest number of leucine-rich repeats (LRRs). Due to the lack of crystal structures of full-length NLRs, projects have been initiated with the aim to model certain or all members of the family, but systematic studies did not model the full-length NLRC5 due to its unique domain architecture. Our aim was to analyze the LRR sequences of NLRC5 and some NLRC5-related proteins and to build a model for the full-length human NLRC5 by homology modeling. RESULTS: LRR sequences of NLRC5 were aligned and were compared with the consensus pattern of ribonuclease inhibitor protein (RI)-like LRR subfamily. Two types of alternating consensus patterns previously identified for RI repeats were also found in NLRC5. A homology model for full-length human NLRC5 was prepared and, besides the closed conformation of monomeric NLRC5, a heptameric platform was also modeled for the opened conformational NLRC5 monomers. CONCLUSIONS: Identification of consensus patterns of leucine-rich repeat sequences helped to identify LRRs in NLRC5 and to predict their number and position within the protein. In spite of the lack of fully adequate template structures, the presence of an untypical CARD domain and unusually high number of LRRs in NLRC5, we were able to construct a homology model for both the monomeric and homo-heptameric full-length human NLRC5 protein

A retrovirális proteázok szerepének vizsgálata a retrovírusok életciklusának korai fázisában = Studies on the retroviral protease in the early phase of life-cycle

A kapsztid (CA) és nukleokapszid (NC) hasítási vizsgálatok elősegítésére számos retrovirális proteázt (PR) jellemeztük, többek között a human T-sejtes leukémia valamint a xenotróp egér leukemia vírus-rokon vírusét is. Igazoltuk a korábban azonosított HIV-1 CA hasítási helyeket, valamint egy új helyet is azonosítottunk. Számos egyszeres és többszörös mutációt hoztunk létre rekombináns, hexahisztidin farokkal expresszált CA fehérjében. A mutánsok proteolitikus érzékenysége jó egyezést mutatott a várt hatásokkal. Ugyanakkor még nyolc mutációval sem sikerült teljesen HIV-1 PR-rezisztenssé tenni a fehérjét. A vizsgált mutációkat bevittük egy harmadik generációs öninaktiválódó lentivírus rendszerbe is. Mind a proteáz érzékeny illetve hasítást gátló CA mutációkat tartalmazó vírusok fertőzőképessége csökkent. Meghatározott vagy jósolt NC fehérje hasítási helyeket tartalmazó oligopeptideket valamint rekombináns NC fehérjéket vizsgáltunk mint PR szubsztrátok. Eredményeink alapján nem csak lentivírus NC fehérjék lehetnek PR szubsztrátok. A virológiai vizsgálatok elősegítésére vizsgáltuk a HIV-1 PR specificitását NC alapú szubsztrátokkal, valamint számos „revertáns” szubsztrátok terveztünk, melyekben a cink-újj motívum belső része nem változott, a hasíthatóságot külső oldalláncok változtatása biztosította. Vizsgáltuk a celluláris protóm változását HIV-1 fertőzés során, és indukálódó fehérjéket azonosítottunk. | To facilitate the comparative capsid (CA) and nucleocapsid (NC) cleavage specificity studies, various retroviral proteases (PRs) were characterized including those of human T-cell lymthotropic and xenotropic murine leukemia virus-related viruses. We verified the previously found cleavage sites in CA of HIV-1 and identified a new one. Single and multiple cleavage site mutations were introduced into a recombinant his-tagged CA. The proteolytic susceptibility of the mutants was in good agreement with the expected changes. However, even eight mutations were not sufficient to make CA resistant towards HIV-1 PR. The studied mutations were introduced into a third generation self-inactivating HIV-1-based lentiviral system. Infectivity assays suggested, that both enhancing and proteolysis inhibitory mutations caused decrease in infectivity. We have studied oligopeptide substrates representing determined or predicted cleavage sites of retroviral nucleocapsid proteins, as well as recombinant NC forms. Cleavage data implied that cleavability of NC sequences might not be restricted to lentiviruses. To facilitate virological studies, we studied the HIV-1 PR specificity with NC-based substrates and designed “revertant” mutants in which cleavability was regained by introducing mutations into close vicinity of the zinc finger motifs. We have also studied the changes in the cellular proteome during the course of HIV-1 infection, and identified proteins with elevated expression