Doğal kefal balığı (marvaki) karaciğerinden sitokrom p4502b-tipi protein: saflaştırılması, biyokimyasal ve immünolojik karakterizasyonu

Cytochrome P450s constitute a superfamily of hemoproteins that play important roles in oxidative metabolism of endogenous and exogenous compounds, and serve as catalysts that are significant in numerous and diverse biological pathways. The extent to which these various pathways or functions occur in different animal groups depend on a large degree on the participation of different P450 proteins present, their catalytic function and their regulation. Cytochrome P4502B subfamily is generally associated with detoxifying metabolism of xenobiotics in experimental animal species and also metabolizes hormones, testosterone and androstedione and several important pharmaceutical agents. The important role of cytochrome P4502B subfamily has been recognized by many biochemists, pharmacologists and toxicologist and has been studied in many different mammalian species. There could be a large number of homologous genes in fish. inIn this study, basic cytochrome P450 that cross-reacted with antibody produced against cytochrome P4502B4 homologue, eluted from the first DEAE- cellulose column was purified to electrophoretic homogeneity by using first and second anion exchange chromatography, and three successive hydroxylapatite column chromatographies. Purified cytochrome P450 was characterized with respect to spectral, electrophoretic, immunochemical and biocatalytic properties. Purified cytochrome P450 gave a single band on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis having monomer molecular weight of 49300 Da. Absolute absorption spectrum of the purified cytochrome P450 showed maximum at 417 ran and CO-difference spectrum of dithionite-reduced cytochrome P450 gave a peak at 450 nm. Purified cytochrome P450 was found to be active in the N- demethylation of benzphetamine, cocaine, erythromycin and ethylmorphine and O-depenthylation of pentoxyresorufin in the reconstituted systems containing purified cytochrome P450 reductase from leaping mullet and synthetic lipid. However, it was unable to catalyze the oxidation of the other monoxygenase substrates such as aniline, lauric acid, 7-ethoxyresorufin, 7-methoxyresorufin and 7-benzyloxyresorufin. Benzphetamine N-demethylase activity was inhibited with proadifen, a cytochrome P4502B inhibitor in reconstituted system. In addition, purified cytochrome P450 showed strong cross-reactivity with the antibody produced against sheep lung cytochrome P4502B4 homologue. The results obtained after accomplishing above studies, strongly suggested that cytochrome P450 purified from leaping mullet is a cytochrome P4502B-type protein. In this study, for the first time, a member of cytochrome P4502B subfamily was purified and characterized in fish species.Sitokrom P450'ler endojen ve ekzojen maddelerin oksidatif metabolizmasında önemli bir rol oynayan ve çok sayıda biyokimyasal reaksiyonda katalizör görevi gören hemoprotein süper ailesini oluşturur. Farklı hayvan gruplarında bu çeşitli reaksiyonların miktarı ve fonksiyonu büyük oranda farklı P450 proteinlerinin katılımına, katalitik fonksiyonuna ve regülasyonüna bağlıdır. Sitokrom P4502B alt ailesi genelde deney hayvanlarında ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ile ilgilidir ve ayrıca hormonları, testosteron ve androstediyonlan ve önemli pharmakolojik kimyasalları metabolize eder. Bu önemli rolü birçok biyokimyacı, pharmakolog ve toksikolog tarafından fark edilmiş ve birçok farklı memelide çalışılmıştır. Benzer genler balıkda da çok sayıda bulunabilir.Bu çalışmada, sitokrom P4502B4 homologuna karşı üretilen antikor ile kuvetli reaksiyon veren ve birinci iyon değişim kolonundan elde edilen bazik sitokrom P450 elektroforetik homojenlikte iki iyon değişim kolon kromatografisi (birinci ve ikinci DEAE-selüloz) ve üç farklı bir birini takip eden adsorpsiyon (Hidroksilapatit) kolon kromatografisi ile saflaştınldı. Saflaştınlan sitokrom P450 spektral, elektroforetik, biyokatalitik ve immunokimyasal özelliklerine göre karakterize edildi. Saflaştırılan sitokrom P450 SDS-poliakrilamit jel elektroforezin de moleküler ağırlığı 49300 olan tek bant verdi. Saf sitokrom P450, mutlak spektrumu 417 nm'de, ditiyonit ile indirgenmiş CO-fark spectrumu 450 ran dalga boyunda maksimum absorbans verdi. Saflaştınlan sitokrom P450 sentetik lipit ve kefal balığı karaciğerinden saflaştırılan P450 redüktaz enzimi ile yeniden oluşturulan mikrozomal monooksijenaz sisteminde benzfetamin, kokain, eritromisin ve etilmorfin N-demetilasyonunda ve pentoksirezorufinin O- depentilasyonunda aktif olduğu bulundu. Fakat, diğer monooksijenaz izozimlerinin substratlanm (anilin, laurik asit, 7-etoksirezorufın, 7- metoksirezorufin ve 7-benziloksirezorufin gibi) metabolize etmedi. Benzfetamin N-demetilaz activitesi yeniden oluşturulmuş ortamda bir sitokrom P4502B inhibitörü olan proadifen ile inhibisyona uğradı. Bunlara ek olarak, saflaştırılan sitokrom P450, sitokrom P4502B4 homologuna karşı üretilen antikor ile reaksiyon verdi. Yukarıdaki çalışmalar gerçekleştirildikten sonra elde edilen sonuçlar kefal karaciğerinden saflaştırılan sitokrom P450'nin bir sitokrom P4502B-tipi protein olduğunu gösterdi. Bu çalışmada, ilk defa sitokrom P4502B alt ailesinin bir üyesi balıktan saflaştırıldı ve karakterize edildi.Ph.D. - Doctoral Progra

Effect of mercury, cadmium, nickel, chromium and zinc on kinetic properties of NADPH-cytochrome P450 reductase purified from leaping mullet (Liza saliens)

Information on the mechanism of metal ion inhibition of NADPH-cytochrome P450 reductase is limited. The purpose of the present paper was to elucidate in vitro effect of Hg(+2), Cd(+2), Ni(+2), Cr(+3) and Zn(+2) ions on the purified mullet NADPH-cytochrome P450 reductase. NADPH-cytochrome P450 reductase was purified from detergent-solubilized liver microsomes from leaping mullet (Liza saliens). All of the metal ions caused inhibition of the enzyme activity except Zn(+2). At 50 mu M metal concentration, Hg(+2) inhibited the cytochrome P450 reductase activity completely (100%), while, at the same concentrations, Cd(+2), Cr(+3) and Ni(+2) caused 66%, 65% and 37% inhibition, respectively. At 50 mu M metal concentration, Zn(+2) had no apparent effect on cytochrome P450 reductase activity. The IC(50) values of HgCl(2), CrCl(3), CdCl(2) and NiCl(2) were estimated to be 0.07 mu M, 24 mu M, 33 mu M and 143 mu M, respectively. Of the metal ions tested, Hg(+2) exhibited much higher inhibitory effect at lower concentrations, so it was evidently a more potent inhibitor than the others. All four metal ions displayed noncompetitive type of inhibition mechanism for the purified reductase as analyzed by Dixon plot. K(i) values of Hg(+2), Cr(+3), Cd(+2) and Ni(+2) were calculated from Dixon plots as 0.048 mu M, 18 mu M, 73 mu M and 329 mu M, respectively

Purification of CYP2B-like protein from feral leaping mullet (Liza saliens) liver microsomes and its biocatalytic, molecular, and immunological characterization

In this study, CYP2B-immunoreactive protein was purified to electrophoretic homogeneity from the liver microsomes of leaping mullet. The purified cytochrome P450 (CYP) gave a single band on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis having a M, of 49,300 Da. Absolute absorption spectrum of the purified CYP showed a maximum at 417 nm and CO-difference spectrum of dithionite-reduced cytochrome P450 gave a peak at 450 nm. The purified CYP was found to be active in N-demethylation of benzphetamine, erythromycin, and ethylmorphine, and O-dealkylation of pentoxyresorufin in the reconstituted system. However, it was unable to catalyze O-dealkylation of ethoxyresorufin, methoxyresorufin, benzyloxyresorufin, and hydroxylation of lauric acid and aniline. The purified CYP showed strong cross-reactivity with anti-sheep lung CYP2B, a homologue of CYP2B4. N-terminal amino acid sequence of the mullet P450 had the highest degree of homology with CYP2Bs among the known CYPs. Spectral, electrophoretic, immunochemical, N-terminal amino acid sequence, and biocatalytic properties of the purified CYP are most similar to those of mammalian cytochrome P4502B. All these data indicate that the purified CYP is certainly 2B-like. In this study, we not only purified biocatalytically active CYP2B-like protein from fish, but also demonstrated detailed functional properties of CYP2B-like protein for the first time. (C) 2008 Wiley Periodicals, Inc

Mechanism of Inhibition of CYP1A1 and Glutathione S-Transferase Activities in Fish Liver by Quercetin, Resveratrol, Naringenin, Hesperidin, and Rutin

Quercetin, resveratrol, naringenin, hesperidin, and rutin are phenolic compounds/flavonoids that may have roles in the reduction of cancer susceptibility. In this study, in vitro modulatory effects of them were studied on liver CYP1A1 associated 7-ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity and glutathione S-transferase (GST) activity of leaping mullet (Liza saliens). All of the phenolic compounds/flavonoids used exerted an inhibitory effect on both EROD and GST activities of fish. Quercetin, resveratrol, hesperidin, and rutin were found to inhibit EROD activity in a competitive manner; on the other hand, naringenin was found to inhibit EROD activity in a noncompetitive manner. Ki values of quercetin, resveratrol, naringenin, hesperidin, and rutin were calculated from Dixon plots as 0.12 mu M, 0.67 mu M, 2.63 mu M, 18 mu M and 0.1mM, respectively. Resveratrol, quercetin, and hesperidin were found to inhibit GST activity in a competitive manner; on the other hand, rutin and naringenin were found to inhibit GST activity in a mixed-type manner. Ki values of resveratrol, quercetin, hesperidin, naringenin, and rutin were calculated from Dixon plots as 3.2 mu M, 12.5 mu M, 45 mu M, 128 mu M, and 150 mu M, respectively. The results suggest that quercetin and resveratrol containing foods are effective in the prevention and treatment of cancer

Inhibition Mechanisms of Lead, Cadmium and Nickel for the Purified Bovine Liver NADPH-Cytochrome P450 Reductase

Very little information is available on the effects of metals in veterinary animals, despite the fact that they are exposed to these chemicals via contaminated plants and water sources. NADPH-Cytochrome P450 reductase is an essential component of the microsomal cytochrome P450 monooxygenase system. In this study, our aim was to elucidate in vitro effect of Pb2+, Cd2+ and Ni2+ on the purified bovine NADPH-cytochrome P450 reductase. NADPH-cytochrome P450 reductase was purified from bovine liver microsomes. The effects of metals were studied by adding various concentrations of them on the reaction mixture. All of the metal ions caused inhibition of the enzyme activity. The IC50 values of Pb2+, Cd2+ and Ni2+ were estimated to be 0.027 mM, 0.059 mM and 2.9 mM, respectively. Of the metal ions tested, Pb2+ exhibited much higher inhibitory effect at lower concentrations. Kinetic analysis was done to determine type of inhibition of purified bovine cytochrome P450 reductase. All of the metal ions displayed noncompetitive type of inhibition mechanism for the purified NADPH-cytochrome P450 reductase as analyzed by Lineweaver-Burk Plot and Dixon plot. Ki values of Pb2+, Cd2+ and Ni2+ were calculated from Dixon plots as 0.03 mM, 0.04 mM and 2.0 mM, respectively. The results of this study clearly indicate that mechanism of inhibition of lead, cadmium and nickel for cytochrome P450 reductase in bovine is noncompetitive type

İzmir Körfezi' ndeki kalıcı ve toksik organik kimyasal madde kirliliğinin biyoteknolojik yöntemlerle belirlenmesi ve izlenmesi

TÜBİTAK YDABAG Proje15.08.2004İzmir Körfezi 1960' lı yıllardan bu yana endüstriyel atıkların, şehir ve zirai bölgelerden dökülen atık suların, gemilerden yayılan petrol atıklarının ve nehirlerin kirli sularının taşıdığı ağır metaller ve kalıcı organik kirleticileride (POPs) içeren organik kimyasallarla ciddi boyutlarda kirlenmiştir. Kalıcı organik kirleticilerden olan PAH, PCB dibenzodioksinler ve dibenzodifuranlar besin zinciri ile konsantre olarak balıklara geçmekte, balıklarda birikmekte ve balıkları yiyen insanlar kirleticilere oldukça yüksek bir değerde maruz kalmaktadır. Bu kimyasallar balık karaciğerinde spesifik olarak sitokrom P4501A (CYP1A) izozimini indukler ki bu enzim PAH/PCB tipindeki prekarsinojen maddeleri toksik ve karsinojenik metabolitlerine dönüştürür. Balıklarda kirliliğe bağlı CYP1A protein miktarı ve ona bağımlı 7-etoksirezorufin O-deetilaz aktivilerindeki artış PAH/PCB ve dioksin tipindeki kirleticilerin varlğının belirlenmesinde en sensitif biyomarker olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem ile hem adı geçen kirleticiye maruz kalınıp kalınmadığı hem de bu maruziyet sonucunda oluşabilecek toksik ve karsinojenik etki ölçülebilmektedir. İzmir Körfez'inde yürüttüğümüz bu çalışmamızda CYP1A protein miktarı ve EROD aktivitelerindeki artış faklı balık türlerinde saptanarak körfezdeki PAH/PCB ve dioksin tipindeki kalıcı organik kirliliğin boyutları tespit edilmiş ve körfezde yaşıyan balık türlerinin bu tip karsinojenik maddelere ne derecede maruz kaldıkları ortaya konmuştur. CYP1A protein düzeyi Western blot tekniği ile daha önce labaratuvarımızda saf kefal P4501A enzimine karşı üretilmiş poliklonal antikor (Arınç and Şen, Marine Environmental Research.; 48, 147, 1999) kullanılarak tayin edildi. Çalışmamızda yüzey (pelajik), dip (sediment/bentik) ve yüzey-dip (bentopelajik) balık türlerini temsil eden üc farklı balık türü kullanıldı bunlar sırası ile kefal (Uza saliens), dil (Solea vulgaris) ve isparoz (Diplodus annularisydur. İç Körfez'de endüstriyel faaliyetlerin ve şehirleşmenin en yoğun olduğu üç bölgeden -Liman, Üçkuyular ve Pasaport- yakalanan kefallerde oldukça yüksek CYP1A protein miktarı ve EROD aktivitesi saptandı. Enzim aktiviteleri Dış Körfez'deki referans bölgesiyle karşılaştırıldığında sırası ile 104,80 ve 73 kat fazla bulundu. Dış Körfez' de bulunan Hekim adasından yakalanan kefallerde gözlenen yüksek EROD aktivitesi (referans bölgesiyle kıyaslandığında 43 kez fazla) bu bölgede PAH/PCB tipi kimyasaların yoğun olarak bulunduğunu göstermektedir. Bu kirliliğin 1976-1990 yılları arasında İzmir İç Körfezi' nin en kirli sedimanlarınm Hekim adasına dökülmesi sonucu oluştuğu düşünülmektedir. Körfez boyunca beş farklı bölgeden yakalanan İzmir Körfezi 1960' lı yıllardan bu yana endüstriyel atıkların, şehir ve zirai bölgelerden dökülen atık suların, gemilerden yayılan petrol atıklarının ve nehirlerin kirli sularının taşıdığı ağır metaller ve kalıcı organik kirleticileride (POPs) içeren organik kimyasallarla ciddi boyutlarda kirlenmiştir. Kalıcı organik kirleticilerden olan PAH, PCB dibenzodioksinler ve dibenzodifuranlar besin zinciri ile konsantre olarak balıklara geçmekte, balıklarda birikmekte ve balıkları yiyen insanlar kirleticilere oldukça yüksek bir değerde maruz kalmaktadır. Bu kimyasallar balık karaciğerinde spesifik olarak sitokrom P4501A (CYP1A) izozimini indukler ki bu enzim PAH/PCB tipindeki prekarsinojen maddeleri toksik ve karsinojenik metabolitlerine dönüştürür. Balıklarda kirliliğe bağlı CYP1A protein miktarı ve ona bağımlı 7-etoksirezorufin O-deetilaz aktivilerindeki artış PAH/PCB ve dioksin tipindeki kirleticilerin varlğının belirlenmesinde en sensitif biyomarker olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem ile hem adı geçen kirleticiye maruz kalınıp kalınmadığı hem de bu maruziyet sonucunda oluşabilecek toksik ve karsinojenik etki ölçülebilmektedir. İzmir Körfez'inde yürüttüğümüz bu çalışmamızda CYP1A protein miktarı ve EROD aktivitelerindeki artış faklı balık türlerinde saptanarak körfezdeki PAH/PCB ve dioksin tipindeki kalıcı organik kirliliğin boyutları tespit edilmiş ve körfezde yaşıyan balık türlerinin bu tip karsinojenik maddelere ne derecede maruz kaldıkları ortaya konmuştur. CYP1A protein düzeyi Western blot tekniği ile daha önce labaratuvarımızda saf kefal P4501A enzimine karşı üretilmiş poliklonal antikor (Arınç and Şen, Marine Environmental Research.; 48, 147, 1999) kullanılarak tayin edildi. Çalışmamızda yüzey (pelajik), dip (sediment/bentik) ve yüzey-dip (bentopelajik) balık türlerini temsil eden üc farklı balık türü kullanıldı bunlar sırası ile kefal (Uza saliens), dil (Solea vulgaris) ve isparoz (Diplodus annularisydur. İç Körfez'de endüstriyel faaliyetlerin ve şehirleşmenin en yoğun olduğu üç bölgeden -Liman, Üçkuyular ve Pasaport- yakalanan kefallerde oldukça yüksek CYP1A protein miktarı ve EROD aktivitesi saptandı. Enzim aktiviteleri Dış Körfez'deki referans bölgesiyle karşılaştırıldığında sırası ile 104,80 ve 73 kat fazla bulundu. Dış Körfez' de bulunan Hekim adasından yakalanan kefallerde gözlenen yüksek EROD aktivitesi (referans bölgesiyle kıyaslandığında 43 kez fazla) bu bölgede PAH/PCB tipi kimyasaların yoğun olarak bulunduğunu göstermektedir. Bu kirliliğin 1976-1990 yılları arasında İzmir İç Körfezi' nin en kirli sedimanlarınm Hekim adasına dökülmesi sonucu oluştuğu düşünülmektedir. Körfez boyunca beş farklı bölgeden yakalanan isparoz balıklarında CYP1A protein miktarlarının ve EROD aktivitelerinin kirliliğe paralel olarak, Liman bölgesinden uzaklaşıldıkca düştüğü gözlendi. Bir sediment/dip balığı olan dilbalığı CYP1A protein miktarları ve EROD aktiviteleri Dış Körfez' deki bazı bölgelerin sedimentlerinin CYP1A indükleyici kimyasallar tarafından kirletildiğini göstermektedir. Örneğin Gediz nehri ağzında gözlenen kirlilik nehrin drenaj alanındaki büyük sanayileşmeyi yansıtmaktadır. İzmir Büyük Kanal Proje'si kapsamında kurulan arıtma sistemi körfeze dökülen evsel ve sanayi atıklarını toplayarak arıttıktan sonra körfeze deşarj etmek üzere 2000 yılında devreye girmiştir. Projemiz kapsamında körfezde yürütmüş olduğumuz biyomonitoring çalışmaları 2002 ve 2003 yıllarını kapsamaktadır. İç Körfez' den yakalanan balıklarda saptanan yüksek EROD aktivitesi ve CYP1A protein miktarı bu bölgede PAH/PCB ve dioksin tipi kirliliğin Kanal Projesi işleyişe geçmesinden önceki yüksek değerlerini koruduğunu göstermektedir. Bunun sonucu olarak İç Körfez' de balık karaciğerinde indüklenen CYP1A, prekarsinojen maddeleri daha fazla karsinojen metabolitlere çevirecek bunlarda DNA'ya bağlanarak mutajenik ve karsinojenik etki gösterecektir. Bu durum hem balıkların hemde bu tür balıkları yiyen insanların sağlığını ciddi boyutlarda tehdit etmektedir. Projemizde biyomonitoring çalışmalarına ek olarak, isparoz balığında dünyada ilk defa sitokrom P450 karışık fonksiyonlu enzim (KFO) aktivitelerinden olan metoksirezorufin O-deetilaz, benzfetamin N-demetilaz, etilmorfin N-demetilaz ve anilin 4-hidroksilaz aktiviteleri karakterize edilmiştir