Pénaeidines, famille de peptides antimicrobiens de crustacés (implication et fonctions dans la réponse immunitaire des crevettes pénéides (Crustacea, Decapoda))

PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Contribution à l'étude de l'ontogenèse du système immunitaire chez l'huître creuse Crassostrea gigas

MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Évaluation des capacités de survie de l'huître creuse Crassostrea gigas suite à des infections bactériennes

L'huître creuse C. gigas a connu des épisodes récurrents de mortalités estivales. En 2009, l'ostréiculture a connu la plus grave crise écologique et économique jamais observée depuis l'introduction de cette espèce sur les côtes françaises. Les études réalisées précédemment dans le but de comprendre les causes de ces mortalités, attribuent une origine multifactorielle faisant intervenir, de manière concomitante, des paramètres environnementaux, des conditions physiologiques particulières de l'huître, en association à la présence de microorganismes pathogènes tels que les vibrions appartenant aux espèces V. aestuarianus, V. splendidus et le virus OsHV-1. Ainsi, l'ensemble des travaux menés au cours de cette thèse représentent une contribution à l'étude d'une réponse immunitaire efficace de l'huître creuse Crassostrea gigas aux infections vibrions pathogènes.Le travail de thèse qui vous a été présenté a été réalisé dans le but de progresser encore sur la compréhension de la réponse immunitaire de l'huître creuse. Ce travail nous a permis d'établir une cartographie des modifications transcriptionnelles par la technique DGE (Digital Gene Expression) et notamment par l'identification d'effecteurs ou mécanismes entrant en jeu dans une réponse efficace vis-à-vis des agents infectieux et conduisant à son élimination. Le modèle (Crassostrea gigas V. aestuarianus/V. splendidus) s'est avéré adapté à cette étude. Les mécanismes identifiés au cours de cette thèse, devront être étudiés plus précisément, puisque la plupart des gènes surreprésentés chez les huîtres survivantes ont des fonctions putatives. Nous avons suggéré l'implication de ces gènes dans le processus de survie des huîtres au cours d'une réponse efficace aux infections bactériennes. Il est apparu nécessaire de développer des recherches autour des défenses de l'huître creuse C. gigas avec pour objectif le développement de stratégies destinées à limiter l'impact des maladies. A long terme, ces stratégies seront applicables soit en prophylaxie afin de détecter des déficiences et prévenir le développement de maladies, soit en sélection génétique pour le criblage de géniteurs présentant des capacités de défenses optimales.Aquatic organisms and particularly marine invertebrates, such as the oyster Crassostrea gigas, harbour an abundant and diverse microflora on their surface (epibiosis) or inside their tissues (endobiosis) where Vibrio splendidus is found as a dominant culturable Vibrio. With Evolution, oysters have developed effective systems for maintaining their homeostasis and discriminating the bacteria beneficial for their physiological fitness from the potentially harmful and pathogenic ones. However, for decades, the cultivated Pacific oyster C. gigas is suffering large scale summer mortality phenomenon that is reported in all areas of the world where this species is cultivated. Considerable effort has been invested in advanced genomic technologies to understand and characterize the major traits that govern the tolerance of oysters to stressful culture conditions and to pathogenic bacteria. In particular, immune-related genes have been characterized from C. giga. Briefly, a variety of antimicrobials have been fully characterized. Whereas most of these immune genes were shown to be modulated during infections, the molecular mechanisms by which the oyster can survive virulent Vibrio infections remained totally unknown. Here, our objective was to develop a better understanding of the genetic-level responses of oysters to pathogenic versus non pathogenic bacteria and to identify genes that are involved in physiological and immune responsiveness to circumvent the infections. In this attempt, we have performed a comprehensive analysis of the transcriptome of oyster immunity (hemocytes), using Digital Gene Expression (DGE). The study aimed to compare the expression profiles of the two libraries and, beyond gene identification and functional annotation, to explore the putative functions involved in the capability of oysters to circumvent and to survive infections. This is the first report on genome-wide transcriptional analysis of oyster survival-responsiveness.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Persistence of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in scallops Pecten maximus

Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), serotype N1 isolated from scallops Pecten maximus in Norway, was propagated and used in both inoculation and bath challenge experiments with scallops in vivo. Although virus titers measured in scallop tissues decreased, depuration of virus was not complete during the experimental periods. IPNV was still detectable 11 mo after injection. The highest virus titer was found in the hepatopancreas, but virus was also detectable in other tissues, as well as in the hemolymph. After a bath challenge, uptake of IPNV was shown. Virus was present in hepatopancreas, gonad, kidney, mantle, gill, rectum and in the hemolymph 1 d after the uptake. The titer was highest in the hepatopancreas where virus was detectable at the end of the experiment, 50 d after challenge. Virus levels in the rectum decreased below detectable levels after Day 30. Titers decreased rapidly in the hemolymph where no virus could be detected after Day 8. Challenges did not result in increased mortality or in clear pathological changes in the scallops. No evidence of viral replication within the scallops was found

Relations entre vitellogenèse et pathologie chez les crustacés (cas de la crevette pénéide)

MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Effecteurs moléculaires de lassociation Crassostrea gigas / Vibrio splendidus. Rôle de la porine OmpU dans les mécanismes de résistance et déchappement à la réponse immunitaire de lhôte.

Vibrio splendidus LGP32 est une bactérie pathogène associée aux épisodes de mortalités estivales qui affectent la production d'huître Crassostrea gigas depuis des décennies. Nous avons montré ici que la porine OmpU était un effecteur majeur de l'interaction V. splendidus / C. gigas. Nous avons pour cela construit un mutant ompU de V. splendidus. Celui-ci nous a permis de mo ntrer l'implication de OmpU (i) dans la résistance de V. splendidus aux antimicrobiens, incluant ceux de l'huître, (ii) dans la fitness chez l'huître, et (iii) dans la virulence en infections expérimentales (mortalités de 56 % pour le sauvage versus pour le 11% mutant). En accord avec ces résultats, nous avons montré que la délétion de ompU modifiait la sécrétion de protéines dont l'expression est contrôlée par les voies de régulation de la virulence (ToxR) et de l'intégrité membranaire (SigmaE). Par ailleurs, nous avons montré que OmpU jouait un rôle essentiel dans la reconnaissance par les hémocytes. En effet, (i) in vivo, les gènes hémocytaires répondent différemment à l'infection par le Vibrio sauvage ou ompU, et (ii) in vitro, OmpU est nécessaire à l'invasion hémocytaire par V. splendidus. Cette invasion utilise la phagocytose dépendante de l'intégrine b et la SOD extracellulaire du plasma d'huître comme opsonine qui lie OmpU. Ainsi, OmpU est un facteur de virulence majeur qui permet l'infection des hémocytes dans lesquels il est capable de survivre en inhibant la formation de radicaux oxygénés et de vacuoles acides. La résistance du Vibrio aux antimicrobiens hémocytaires de l'huître, elle-même dépendante de OmpU, est probablement un élément supplémentaire favorable à la survie intra-cellulaire.Vibrio splendidus LGP32 is a bacterial pathogen associated to the summer mortality outbreaks that have affected the production of Crassostrea gigas oysters over the past decades. We showed here that the OmpU porin is a major effector of the V. splendidus / C. gigas interaction. For that, we have constructed a ompU mutant of V. splendidus, and shown that the OmpU porin is implicated (i) in the resistance of V. splendidus to antimicrobials, including those of oyster, (ii) in its in vivo fitness, and (iii) in its virulence in oyster experimental infections (mortalities have been reduced from 56 % to 11 % upon mutation). In agreement, we have shown that the ompU deletion modified the expression of secreted proteins controlled by the virulence (ToxR) and the membrane integrity (SigmaE) regulation pathways. Furthermore, we have shown that OmpU has a major role in the recognition of V. splendidus by oyster hemocytes. Indeed, (i) in vivo, hemocyt e genes displayed differential responses to an infection with the wild-type or the ompU mutant, and (ii) in vitro, OmpU was necessary for hemocyte invasion by V. splendidus. This invasion process required the hemocyte b-integrin and the oyster plasma extracellular SOD, which was found to act as an opsonin recognizing OmpU. Thus, OmpU is a major virulence factor that allows infection of hemocytes in which V. splendidus is able to survive by inhibiting the production of reactive oxygen species and the formation of acidic vacuoles. Resistance of V. splendidus to hemocyte antimicrobials, which is also OmpU-dependant, is probably an additional determinant of V. splendidus intracellular survival.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Signature d'expression de gènes, Marqueur prédictif de capacités de survie chez l'huître Crassostrea gigas

Dans le contexte des mortalités massives d'huîtres Crassostrea gigas, les mécanismes moléculaires et les bases génétiques impliquées dans la capacité de survie des huîtres ont été explorées par des approches de génomique à très haut débit. Ces travaux se sont centrés dans un premier temps sur la survie à des infections par des Vibrio virulents pour lesquels des infections expérimentales étaient reproductibles et standardisées en laboratoire. Ces analyses ont conduit à la mise en évidence d'une série de gènes dont l’expression peut prédire la capacité des huîtres à survivre aux infections à vibrios (Rosa et al. 2012). Depuis 2013, les travaux ont permis la validation de la signature de survie qui a pu être corrélée avec les capacités de survie des huîtres en conditions d’épisodes de mortalités in situ dans l’Etang de Thau. La signature a discriminé les huîtres qui sont capables de survivre de celles qui vont mourir avec 73% de prédiction de survie. L’objectif de l'approche est d’utiliser cette signature comme outil de criblage ou phénotypage, non destructeur, d'huîtres présentant des traits génétiques leur conférant une meilleure résistance aux mortalités in situ ou aux pathogènes et ce dans un objectif de prophylaxie ou en soutien de programmes de sélection. Pour poursuivre cet objectif, l'action Prédigène s'est proposée d'étudier (1) l'héritabilité de la signature d’expression de gènes, marqueur prédictif de capacité de survie, c'est-à-dire la transmission à la descendance de traits génétiques conférant de meilleures capacités de survie. Pour cela, des individus d'une population sauvage d'huîtres ont été phénotypés par la signature moléculaire sur la base d'analyses de qPCR haut débit Fluidigm et biostatistiques. Ainsi trois groupes d'huîtres ont été identifiés en fonction d'un index individuel caractérisant soit un potentiel de bonne survie [S+], un potentiel de mauvaise survie [S-] et des témoins [T] sans discrimination du phénotype. Des croisements en intra-lots ont été réalisés sous sélection divergente d'intensité de 10%. Enfin, chez les descendants, l'index de potentiel de survie a été établi sur des naissains de chaque lignée sélectionnée afin de calculer l'héritabilité de la signature. Les résultats ont montré des héritabilités fortes à modérées pour les index de survie, de 0.88 pour la lignée [S-] à 0.39 pour la lignée [S+],indiquant la possibilité de développer des programmes de sélection pour améliorer ou diminuer ce caractère.Il sera toutefois nécessaire de produire plusieurs générations de sélection afin d’obtenir une meilleure mesure de la réponse moyenne par génération de la sélection. Par ailleurs, Prédigène avait aussi pour objectif (2) d'évaluer l'impact environnemental des conditions d'élevage sur les taux de survie des différentes lignées et le phénotype [S]. En effet, la signature prédictive de survie a été caractérisée dans des contextes de mortalités en milieu méditerranéen. Les 3 familles ont été déployées dans le cadre du réseau RESCO dans quatre environnements géographiques et climatiques contrastés de Normandie (Baie des Veys), Bretagne Nord (Brest), Marennes-Oléron (Baie de Bourgneuf) et Méditerranée (Marseillan) pour analyser l'impact environnemental sur le phénotype de survie. Alors que sur les sites d'élevage de la façade Atlantique, aucune différence des taux de survie n'a été observée entre les 3 familles [S+], [S-] et [T], sur Marseillan, des taux de survie significativement supérieurs ont été observés chez les huitres [S+] par rapport aux familles [S-]. De ces résultats, il ressort que la signature moléculaire étudiée dans le cadre de Predigène révèlerait un potentiel de survie des huîtres à des conditions environnementales (biotiques et abiotiques) plus spécifiques à l'Etang de Thau. Ces résultats montrent surtout que, en exploitant le fort potentiel adaptatif et polymorphisme de l'espèce, l'approche de phénotypage par signature moléculaire pourrait être appliquée pour produire rapidement des souches d'huîtres adaptées à différentes conditions environnementales et/ou résistantes à différents pathogènes. Face à la crise que subit la conchyliculture, la production de souches locales et adaptées aux conditions environnementales spécifiques aux différentes zones ostréicoles régionales permettrait à terme de sécuriser la filière en réduisant les risques zoosanitaires et les conditions de stress des animaux liés aux transferts

High polymorphism in big defensin gene expression reveals presence-absence gene variability (PAV) in the oyster Crassostrea gigas

We report here the first evidence in an invertebrate, the oyster Crassostrea gigas, of a phenomenon of Presence-Absence Variation (PAV) affecting immune-related genes. We previously evidenced an extraordinary interindividual variability in the basal mRNA abundances of oyster immune genes including those coding for a family of antimicrobial peptides, the big defensins (Cg-BigDef). Cg-BigDef is a diverse family composed of three members: Cg-BigDef1 to -3. Here, we show that besides a high polymorphism in Cg-BigDef mRNA expression, not all individual oysters express simultaneously the three Cg-BigDefs. Moreover, in numerous individuals, no expression of Cg-BigDefs could be detected. Further investigation at the genomic level revealed that in individuals in which the transcription of one or all Cg-BigDefs was absent the corresponding Cg-bigdef gene was missing. In our experiments, no correlation was found between Cg-bigdef PAV and oyster capacity to survive Vibrio infections. The discovery of P-A immune genes in oysters leads to reconsider the role that plays the immune system in the individual adaptation to survive environmental, biotic and abiotic stresses

Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei (Decapoda)

We report here the isolation of three members of a new family of antimicrobial peptides from the hemolymph of shrimps Penaeus vannamei in which immune response has not been experimentally induced. The three molecules display antimicrobial activity against fungi and bacteria with a predominant activity against Gram-positive bacteria. The complete sequences of these peptides were determined by a combination of enzymatic cleavages, Edman degradation, mass spectrometry, and cDNA cloning using a hemocyte cDNA library. The mature molecules (50 and 62 residues) are characterized by an NH2-terminal domain rich in proline residues and a COOH-terminal domain containing three intramolecular disulfide bridges. One of these molecules is post-translationally modified by a pyroglutamic acid at the first position. Comparison of the data obtained from the cDNA clones and mass spectrometry showed that two of these peptides are probably COOH-terminally amidated by elimination of a glycine residue. These molecules with no evident homology to other hitherto described antimicrobial peptides were named penaeidins