Role of HBV DNA mutations in HBV recurrence in liver transplant recipients

Hepatit B virüsüne (HBV) bağlı son dönem karaciğer hastalığı, ülkemizde önemli bir karaciğer transplantasyonu sebebidir. HBV'ye bağlı nedenlerle karaciğer transplantasyonu uygulanan hastalarda greftin tekrar infeksiyonu (rekürrens) mortalite ve morbiditeyi arttırması bakımından günümüzde önemini koruyan bir problemdir. Rekürrensin önlenmesi için kullanılan Hepatit B immün globulin (HBIG) ve revers transkriptaz (RT) inhibitörleri, virüs üstünde baskı oluşturmakta, virüs replikasyonunun devam etmesi durumunda bu tedavilere dirençli virüs mutantları seçilebilmektedir. Çalışmamızda, merkezimizde karaciğer transplantasyonu sonrası rekürrens görülen ve plazma HBV DNA'sı pozitifleşen hastalardaki mutasyon profilinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun için, 01/02/1997-06/08/2009 tarihleri arasında Dokuz Eylül Üniversite Hastanesi'nde kronik HBV infeksiyonuna bağlı komplikasyonlar nedeniyle karaciğer transplantasyonu uygulanmış ve transplantasyon sonrası HBV DNA'sı pozitifleşmiş hastalara ait plazmalar çalışmaya dahil edilmiştir. HBV'ye ait PreS/S ve bununla örtüşen RT gen bölgesi polimeraz zincir tepkimesi (PZT) ile çoğaltılarak Sanger yöntemiyle çift yönlü dizi analizi yapılmıştır. Analiz sonuçları, referans dizilerle karşılaştırılarak mutasyon ve varyasyonlar belirlenmiştir. Transplantasyon sonrasında HBV DNA pozitifleşmiş 13 hastanın beşinde (%38,5) RT geninde ilaç direnç mutasyonu, üçünde (%23,1) antikordan kaçışla ilişkili S geni mutasyonu, üçünde ise (%23,1) her iki tip mutasyon birlikte görülmüştür. İki hastada (%15,4) dirençle ilgili mutasyon saptanmamıştır. Onüç hastadan transplantasyon sonrası serum HBsAg'si pozitifleşen hastalar değerlendirildiğinde dokuz hastanın üçünde ilaç direnç mutasyonu (%33,3), üçünde kaçışla ilişkili S geni mutasyonu (%33,3), üçünde her iki tip mutasyon birlikte görülmüştür (%33,3). İlaç direnci görülen sekiz hastanın üçünde transplantasyon öncesi sekans verileri elde edilmiş, hastalarda bu dönemde de ilaç direnç mutasyonları bulunduğu saptanmıştır. Transplantasyon öncesi sekans verisi edilen diğer üç hastanın birinde antikordan kaçışla ilgili mutasyon görülmüş, bu mutasyonun transplantasyon öncesi de bulunduğu belirlenmiştir. Saptanan antikordan kaçışla ilgili mutasyonlar: sY100C, sT118K, sP120T, sT123A, sT131N, sM133L, sD144A'dır. Literatürde en sık bildirilen sG145R mutasyonuna rastlanmamıştır. Bir hastada, "a" determinantı'nda literatürde hakkında bilgi olmayan sN146H mutasyonu saptanmıştır. Transplantasyon sonrası görülen ilaç direnci paternleri rtL80I + L180M + A181V + M204V; rtL180M + S202G + M204V; rtL180M + M204V; rtM204I + L80V; rtM204I + L80I; rtM204I; rtA181V'dir. PreS2 bölgesinde iki hastada (%15,4) delesyonlar saptanmıştır. Bir hastada PreS1 bölgesinin "S promoter" CCAAT motifinde CCAAG değişimi görülmüştür. Çalışmamızda, rekürrens görülen hastalarda saptanan antiviral direnç oranları (66.6%), benzer çalışmalarda bildirilen oranlara (47-59%) yakındır. Transplantasyon öncesi saptanan mutasyonlar, transplantasyon sonrasına da yansımaktadır. Bu nedenle, transplantasyon öncesi anti-viral ilaç kullanılmasına karşın HBV DNA pozitifliği devam eden hastalarda direnç profilinin belirlenmesi, transplantasyon sonrası uygulanacak profilaksiyi yönlendirerek rekürrensi önlemede faydalı olabilir. End-stage liver disease due to HBV is an important indication for liver transplanation in Turkey. Re-infection of the greft tissue with HBV in patients who underwent orthotopic liver transplantation increases mortality and morbidity, and still remains an important problem. Hepatitis B immune globulin (HBIG) and reverse transriptase (RT) inhibitor agents, which are used as prophylactic measures to prevent greft re-infection, exert selective pressure on the HBV virus, which may lead to selection of viral mutants that are less sensitive to treatment, resulting in HBV recurrence. In this study, we aimed to reveal the mutation profile of HBV in liver transplant patients with recurrent HBV disease having positive plasma HBV DNA despite prophylaxis. The study population was consisted of patients who underwent orthotopic liver transplantation in Dokuz Eylül University Hospital between 01/02/1997 - 06/08/2009 with positive plasma HBV DNA in post-transplantion period. PreS/S and RT regions of HBV DNA were obtained by PCR, and amplicons were sequenced using Sanger's method. Mutations and variations were determined by comparing with reference sequences. Sequence analysis of HBV in 13 patients who had plasma HBV DNA positivity post transplant revealed anti-viral resistance mutations in five patients (38.5%), antibody escape mutations in the S gene in three patients (23.1%), and both type of mutations in three patients (23.1%). Two patients did not show any mutations (15.4%). Nine patients had HBsAg positivity along with HBV DNA positivity in the post-transplantation period. The evaluation of patients in this group revealed anti-viral resistance mutations in three patients (33.3%), antibody escape mutations of the S gene in three patients (33.3%), and both types of mutations in three patients (33.3%). All patients had at least one type of mutation that may be attributed to recurrence. It was possible to sequence pre-transplant samples of three patients among eight who showed anti-viral resistance and the sequences showed the presence of antiviral resistance mutations before the transplantation. Mutations related to antibody escape found in this study are as follows: sY100C, sT118K, sP120T, sT123A, sT131N, sM133L, sD144A. One of the most frequently reported antibody escape mutations in the literature, sG145R, was not present in any of the patients. In one patient, sN146H was present within the "a" determinant. Search of the literature did not reveal any information about this mutation. Resistance patterns post-transplantation period were rtL80I + L180M + A181V + M204V; rtL180M + S202G + M204V; rtL180M + M204V; rtM204I + L80V; rtM204I + L80I; rtM204I; rtA181V. Two patients (15,4%) had deletions in the PreS2 region. In one patient, there was a mutation in the S promoter of the preS1 region, located within the CCAAT box (CCAAT  CCAAG). The antiviral resistance mutation rate found in the study population with HBV recurrence (66.6%) was comparable to similar studies in the literature (47-59%). Pretransplant mutations mostly continued to be present in the post-transplant samples. Therefore, mutation analysis of patients with positive HBV DNA despite the use of anti-viral drugs, in the pre-transplantation period may help determine the right prophylaxis option after the tranplantation in order to prevent the HBV recurrence