Funktionelle Charakterisierung von AtCPK1 und AtCPK2 aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer chemisch-genetischen Methode

Kalzium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) haben eine biologische Funktion in einer Reihe von zellulären Prozessen, was durch Überexpressionsanalysen und auf Kosuppression-basierten Silencing-Untersuchungen gezeigt werden konnte. Die Untersuchung von CDPK-Mutanten hat jedoch bisher, vermutlich aufgrund der hohen funktionellen Redundanz oder aufgrund von Anpassungsmechanismen der Pflanzen, zu keinen phänotypischen Auffällig¬keiten geführt. Ausschließlich im Falle von NtCDPK2 aus Tabak war es bislang möglich, die biologische Funktion einer einzelnen Isoform aufzuklären. In dieser Arbeit wurde eine chemisch-genetische Methode etabliert, die es ermöglicht, isoformspezifische Untersuchungen von CDPKs durchzuführen. Eine Mutation der ATP-Bindetasche verändert die Nukeotid¬binde¬eigen¬schaften von CDPKs daraufhin, dass sie durch den Kinaseinhibitor 1 NA-PP1 inhibiert werden können. Durch eine biochemische Charakterisierung von NtCDPK2 als Modellenzym konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser Mutation in CDPKs um eine funktionell stille Mutation handelte, die keinen Einfluss auf die Kinase¬aktivität und die Substratspezifität hat. Für eine funktionelle Charakterisierung wurden basierend auf Microarray-Expressions¬daten die beiden zu NtCDPK2 homologen Isoformen AtCPK1 und AtCPK2 aus A. thaliana ausgewählt. Anhand klassischer genetischer Methoden, wie der Analyse von Promotor-GUS Linien, konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtCPK1 um eine ubiquitär exprimierte CDPK handelt. AtCPK2 zeigte hingegen eine spezifische Lokalisation in der Wurzelspitze und in Zellen, die sich durch Spitzenwachstum auszeichnen, wie beispielsweise Pollen. Eine Untersuchung des Pollenschlauchwachstums in cpk2-Mutanten zeigte, dass die Pollen¬schläuche signifikant kürzer waren als in Wildtyppflanzen. Für eine reverse chemisch-genetische Analyse von AtCPK1 nach Kältestress wurde eine T-DNA Insertionslinie dieser Isoform mit der ATP-Bindetaschen¬variante von AtCPK1 komple¬mentiert. Eine Analyse von Veränderungen im Phosphoproteom nach Kältestress identi¬fizierte 5 Proteine, die ein differentielles Phosphorylierungsmuster nach chemischer Inhibition zeigten. Eine Metabolomanalyse ergab verschiedene Metabolite, die differentiell reguliert wurden. In dieser Arbeit konnte durch eine klassische Mutantenanalyse von AtCPK2, die Etablierung einer chemisch-genetischen Methode für die Analyse von CDPKs und deren Anwendung für AtCPK1 Hinweise auf biologische Funktionen dieser Isoformen erhalten werden. Dies zeigt, dass die chemisch-genetische Methode klassische genetische Ansätze bei der funktionellen Charakterisierung von CDPKs ergänzen kann und, wie im Falle von AtCPK1, oftmals als einzige Methode eine isoformspezifische Untersuchung gestattet. In einem zweiten Teil wurde in dieser Arbeit die Phosphoregulation von CDPKs näher untersucht. Nach Expression in N. benthamiana konnte eine weitere, stimulusabhängige in vivo Phospho¬rylierungs¬stelle in AtCPK2 bestimmt werden. Zudem wurde für eine Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche von NtCDPK2 eine mögliche Funktion in der Regulation der Kinase¬aktivität postuliert. Diese Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche könnte die Basis eines noch nicht beschriebenen Regulationsmechanismus bilden, der Ähnlichkeiten mit der Regulation von Cyclin-abhängigen Kinasen hat

Funktionelle Charakterisierung von AtCPK1 und AtCPK2 aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer chemisch-genetischen Methode

Kalzium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) haben eine biologische Funktion in einer Reihe von zellulären Prozessen, was durch Überexpressionsanalysen und auf Kosuppression-basierten Silencing-Untersuchungen gezeigt werden konnte. Die Untersuchung von CDPK-Mutanten hat jedoch bisher, vermutlich aufgrund der hohen funktionellen Redundanz oder aufgrund von Anpassungsmechanismen der Pflanzen, zu keinen phänotypischen Auffällig¬keiten geführt. Ausschließlich im Falle von NtCDPK2 aus Tabak war es bislang möglich, die biologische Funktion einer einzelnen Isoform aufzuklären. In dieser Arbeit wurde eine chemisch-genetische Methode etabliert, die es ermöglicht, isoformspezifische Untersuchungen von CDPKs durchzuführen. Eine Mutation der ATP-Bindetasche verändert die Nukeotid¬binde¬eigen¬schaften von CDPKs daraufhin, dass sie durch den Kinaseinhibitor 1 NA-PP1 inhibiert werden können. Durch eine biochemische Charakterisierung von NtCDPK2 als Modellenzym konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser Mutation in CDPKs um eine funktionell stille Mutation handelte, die keinen Einfluss auf die Kinase¬aktivität und die Substratspezifität hat. Für eine funktionelle Charakterisierung wurden basierend auf Microarray-Expressions¬daten die beiden zu NtCDPK2 homologen Isoformen AtCPK1 und AtCPK2 aus A. thaliana ausgewählt. Anhand klassischer genetischer Methoden, wie der Analyse von Promotor-GUS Linien, konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtCPK1 um eine ubiquitär exprimierte CDPK handelt. AtCPK2 zeigte hingegen eine spezifische Lokalisation in der Wurzelspitze und in Zellen, die sich durch Spitzenwachstum auszeichnen, wie beispielsweise Pollen. Eine Untersuchung des Pollenschlauchwachstums in cpk2-Mutanten zeigte, dass die Pollen¬schläuche signifikant kürzer waren als in Wildtyppflanzen. Für eine reverse chemisch-genetische Analyse von AtCPK1 nach Kältestress wurde eine T-DNA Insertionslinie dieser Isoform mit der ATP-Bindetaschen¬variante von AtCPK1 komple¬mentiert. Eine Analyse von Veränderungen im Phosphoproteom nach Kältestress identi¬fizierte 5 Proteine, die ein differentielles Phosphorylierungsmuster nach chemischer Inhibition zeigten. Eine Metabolomanalyse ergab verschiedene Metabolite, die differentiell reguliert wurden. In dieser Arbeit konnte durch eine klassische Mutantenanalyse von AtCPK2, die Etablierung einer chemisch-genetischen Methode für die Analyse von CDPKs und deren Anwendung für AtCPK1 Hinweise auf biologische Funktionen dieser Isoformen erhalten werden. Dies zeigt, dass die chemisch-genetische Methode klassische genetische Ansätze bei der funktionellen Charakterisierung von CDPKs ergänzen kann und, wie im Falle von AtCPK1, oftmals als einzige Methode eine isoformspezifische Untersuchung gestattet. In einem zweiten Teil wurde in dieser Arbeit die Phosphoregulation von CDPKs näher untersucht. Nach Expression in N. benthamiana konnte eine weitere, stimulusabhängige in vivo Phospho¬rylierungs¬stelle in AtCPK2 bestimmt werden. Zudem wurde für eine Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche von NtCDPK2 eine mögliche Funktion in der Regulation der Kinase¬aktivität postuliert. Diese Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche könnte die Basis eines noch nicht beschriebenen Regulationsmechanismus bilden, der Ähnlichkeiten mit der Regulation von Cyclin-abhängigen Kinasen hat

ARABIDOMICS- Integration of alterations on transcript, protein and metabolite level of Arabidopsis thaliana exposed to simulated microgravity

The requirement for plants as food and oxygen sources during prolonged manned space travels caused an increased interest in the identification of genes involved in plant-adaptation to microgravity. Transcriptomic, proteomic and metabolomic techniques provide a sensitive high-throughput approach to identify regulations in response to changes of the gravitational force. The ARABIDOMICS project generated and correlated omics data (on the transcript, protein and metabolite level) that support the assumption that simulated microgravity has a strong impact on plant cell wall biosynthesis and structure, phytohormone biosynthesis and signaling, generation of toxic compounds (reactive oxygen species), secondary metabolite biosynthesis and cytoskeleton organisation in Arabidopsis thaliana roots

WRKY43 regulates polyunsaturated fatty acid content and seed germination under unfavourable growth conditions

Seed germination and postgerminative growth of Arabidopsis thaliana and various other plant species are arrested in response to unfavourable environmental conditions by signalling events involving the phytohormone abscisic acid (ABA). In this study, we showed that loss of the seed-specific WRKY DNA-BINDING PROTEIN 43 (WRKY43) conferred increased tolerance towards high salt, high osmolarity and low temperature during seed germination in Arabidopsis. The wrky43 loss of function lines displayed increased inhibition of seed germination in response to exogenous ABA; whereas lines overexpressing WRKY43 were more tolerant towards exogenous ABA. Biochemical analysis of fatty acid composition revealed that loss of WRKY43 increased polyunsaturated fatty acid content in seeds, particularly 18:2Δ9,12 and 18:3Δ9,12,15 in triacylglycerols and phospholipids, indicating an important physiological effect on fatty acid desaturation with ramifications for the tolerance of plants to cold and osmotic stress and possibly, for oilseed engineering. Molecular analyses showed that ABA-induced regulation of FUSCA3, ZAT10 and seed storage proteins were absent in the wrky43 mutant. In summary, WRKY43 encodes for a novel positive regulator of ABA-dependent gene regulation and as a potent modulator of fatty acid desaturation and seed filling, which results in increased tolerance to abiotic stress.</p

Structural and functional heat stress responses of chloroplasts of arabidopsis thaliana

Temperature elevations constitute a major threat to plant performance. In recent years, much was learned about the general molecular mode of heat stress reaction of plants. The current research focuses on the integration of the knowledge into more global networks, including the reactions of cellular compartments. For instance, chloroplast function is central for plant growth and survival, and the performance of chloroplasts is tightly linked to the general status of the cell and vice versa. We examined the changes in photosynthesis, chloroplast morphology and proteomic composition posed in Arabidopsis thaliana chloroplasts after a single or repetitive heat stress treatment over a period of two weeks. We observed that the acclimation is potent in the case of repetitive application of heat stress, while a single stress results in lasting alterations. Moreover, the physiological capacity and its adjustment are dependent on the efficiency of the protein translocation process as judged from the analysis of mutants of the two receptor units of the chloroplast translocon, TOC64, and TOC33. In response to repetitive heat stress, plants without TOC33 accumulate Hsp70 proteins and plants without TOC64 have a higher content of proteins involved in thylakoid structure determination when compared to wild-type plants