Genotoksik Stres İndüklü Otofaji İlişkili Sekretom’un Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Antitümör İmmün Yanıt Üzerine Etkisinin Araştırılması

Amaç: Bu tezin amacı, kemoterapi ajanı etoposid ile indüklenen genotoksik stres aracılı otofajiye bağlı oluşan otofajik sekretomun karakterize edilmesi ve bu sekretom içeriğinin MCF-7 meme kanseri hücrelerine yönelik NK aracılı immün cevabı etkileyip etkilemediğinin araştırılmasıdır. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada MCF-7, kontrol-NK92 ve DNAM1-NK92 hücre dizileri kullanılmıştır. Etoposid aracılı otofaji indüksiyonu, LC3I/II ve p62 western blot ve immünfluoresan analizleriyle ölçülmüştür. Hücrelerde apoptoz oranı Annexin V/7AAD analizi ile ölçülmüştür. Otofajik sekretom karakterizasyonu LC/MS-MS ve sitokin array analizleri ile yapılmıştır. Sitokinlerin validasyonu da ELISA analizi ile yapılmıştır. Kontrol-NK92 ve DNAM1-NK92 hücrelerinin MCF-7 hücrelerini hedefleme kapasitesi degranülasyon analizi ile belirlenmiştir. Bulgular: 24 saat süre ile 150 μM Etoposid ile MCF-7 hücrelerinde otofajinin indüklendiği LC3I/II ve p62 gibi otofaji belirteçleri ile gösterilmiştir ve kemoterapi indüklü otofajinin apoptoza neden olmadığı tespit edilmiştir. LC/MS-MS sonuçları ile kemoterapi indüklü otofaji sırasında metabolik enzimlerin, tümör antijenlerinin, şaperonlar ve metastazla ilişkili proteinlerin salgılandığı tespit edilmiştir. Ayrıca, sitokin array analizi ile de sekretom içerisinde 41 farklı sitokin/kemokin ve büyüme faktörü tespit edilmiştir ve CCL5, TGFβ ve IL10 gibi bazı sitokin, kemokin ve büyüme faktörü için ELISA analizleri ile validasyon yapılmıştır. Son olarak, kontrol NK-92 ve DNAM1-NK92 hücrelerinin otofajik sekretomlarla muamele edilmesinin ardından, MCF-7 hücrelerini hedefleme kapasitesinde gruplar arasında farklılıklar olduğu görülmüştür. Sonuç: Tez kapsamında ilk kez kemoterapi ile indülenen otofajik sekretomun içeriği tümüye karakterize edilmiştir. İn vitro şartlarda, kemoterapiye bağlı otofaji indüksiyonunun NK hücre efektör fonksiyonlarını uyarıp uyarmadığını ve antikanser aktivitesine katkıda bulunan ilaç xiv kaynaklı stres türlerini nasıl algıladığını ve bunlara nasıl tepki verdiğini belirlemede önemli veriler elde edilmiştir.Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri birimi TPF-21017SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ vii ŞEKİLLER DİZİNİ viii TABLOLAR DİZİNİ xii ÖZET xiii ABSTRACT xv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Otofaji 3 2.1.1. Otofajinin Sınıflandırılması 4 2.1.1.1. Makrotofaji 4 2.1.1.2. Mikrotofaji 5 2.1.1.3. Şaperon Aracılı Otofaji (CMA) 5 2.1.2. Otofajinin Moleküler Mekanizması 6 2.1.2.1. İnisiyasyon 6 2.1.2.2. Nükleasyon 7 2.1.2.3. Fagofor Uzaması 8 2.1.2.4. Otofagozomun Lizozom ile Birleşmesi 9 2.2. Genotoksik Stres İndüklü Otofaji 10 2.3. Otofaji Kanser İlişkisi 12 2.3.1. Tümorogenezin Baskılanmasında Otofajinin Rolü 13 2.3.2. Tümorogenezin Gelişiminde Otofajinin Rolü 14 2.3.3. Kanserde Otofajinin Hedeflenmesi 16 2.4. Otofajik Sekretom 17 2.5. Otofaji ve İmmün sistem İlişkisi 19 2.6. Doğal Öldürücü Hücreler (Natural Killer: NK) 22 2.6.1. NK Hücre Biyolojisi 22 2.6.2. NK Hücre Aktivatör ve İnhibitör Reseptörleri 23 NK hücre aktivatör, inhibitör ve ko-reseptörleri 24 2.6.3. NK Hücre Aracılı Hücresel Sitotoksisite 24 2.6.4. NK Hücrelerinde Efektör İmmün Yanıt 26 2.6.5. NK Hücre Kaynakları 27 2.6.6. NK Hücrelerinde Genetik Modifikasyon ve Kanser İmmünoterapisinde Kullanımı 28 2.7. Otofajinin Doğal Öldürücü Hücreler (NK) Üzerindeki Etkisi 30 2.8. Çalışmanın Amacı 33 3. GEREÇ VE YÖNTEM 35 3.1. Gereç 35 3.1.1. Çalışmada Kullanılan Hücre Dizileri 35 3.1.2. Çalışmada Kullanılan Besiyeri ve Kimyasallar 35 3.1.3. Çalışmada Kullanılan Antikorlar 36 3.1.5. Kullanılan Kitler 37 3.1.6. Kullanılan Cihazlar ve Aletler 37 3.2. Yöntem 38 3.2.1. Hücre Kültürü Çalışmaları 38 3.2.2. Hücrelerin Pasajlanması 39 3.2.3. Hücrelerin Dondurulup Saklanması 39 3.2.4. Hücrelerin Çözdürülüp Kullanılması 39 3.2.5. Hücrelerin Sayım Yöntemi 40 3.2.6. MCF-7 Hücre Hattında Otofaji İndüksiyonu ve İnhibisyonu 40 3.2.6.1. MCF-7 Hücrelerinde Genotoksik Stres İndüksiyonu ve Modülasyonu Sonrası Otofaji Belirteçlerinin Western Blot Analizi ile Belirlenmesi 41 3.2.6.1.1. Protein İzolasyonu 41 3.2.6.1.2. Protein Miktar Tayini 42 3.2.6.1.3. Western Blot analizi 42 3.2.6.2. Annexin V/7AAD apoptozis testi 46 3.2.6.3. İmmünfluoresan Boyama ve Konfokal Mikroskopi 46 3.2.6.4. DCFDA ROS Analizi 47 3.2.7.1. Koşullandırılmış Ortam (Conditioned medium: CM) toplanması 47 3.2.7.2. LC-MS/MS Analizi 48 3.2.7.2.1. Protein Özütlerinin Hazırlanması 48 3.2.7.2.2. Proteinlerin Çözelti İçi Kesimi 48 3.2.7.2.3. Nano-sıvı Kromatografisi Kütle Spektrometrisi (nLC-MS/MS) Analizi 49 3.2.7.2.4. nLC-MS/MS Veri Analizi 50 3.2.7.2.5. Biyoinformatik Analizler 50 3.2.7.2.6. LC-MS/MS Sonuçlarının Analizi 51 3.2.7.3. Sitokin Array Analizi 51 3.2.7.4. ELISA Analizleri 51 3.2.8. Kemoterapi İndüklü Otofajinin, NK Hücrelerinin Anti-tümör İmmün Cevabına Etkisi 52 3.2.8.1. NK-92’nin Tümör Hücrelerini Hedefleme Kapasitesinin Belirlenmesi 52 3.2.8.1.1. Degranülasyon Analizi (Degranulation assay) 52 3.2.8.1.2. DNAM1 Ekspresyonunun Flow Sitometri ile Analizi 54 3.2.9. Grafiklerin Hazırlanışı ve İstatistiksel Analizlerin Belirlenmesi 55 4. BULGULAR 56 4.1. Genotoksik Stres Aracılı Otofaji İndüksiyonu ve Modülasyonu 56 4.1.1. MCF-7 Hücrelerinde Genotoksik Stres İndüksiyonu Sonrası Otofaji Belirteçlerindeki (LC3I/II ve p62) Değişim 56 4.1.2. MCF-7 Hücrelerinde Genotoksik Stres İndüklü Otofajide LC3 Punkta Oluşumunun Belirlenmesi 57 4.1.3. MCF-7 Hücrelerinde Genotoksik Strese Bağlı Hücre Ölümünün Belirlenmesi 58 4.1.4. MCF-7 Hücrelerinde Genotoksik Stres İndüklü Otofajinin Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Düzeyine Etkileri 59 4.2. Genotoksik Stres Aracılı Otofaji İndüksiyonu ve Inhibisyonu Sonrası Otofajik Sekrotom Karakterizasyonu 61 4.2.1. %1 FBS Ortamının Hücre Ölümüne Etkileri 62 4.2.2. MCF-7 Hücrelerinde Genotoksik Stres İndüklü Otofajik Sekretom İçeriğinin LC-MS/MS ile Belirlenmesi 63 4.2.2.1. LC-MS/MS Verilerinin Biyoinformatik Analiz Sonuçları 66 4.2.3. Genotoksik Stes İndüklü Otofajik Sekretomda Sitokin/Kemokin ve Büyüme Faktörlerinin Belirlenmesi 71 4.2.3.1. Otofajik Sekretomda Öne Çıkan Sitokin/Kemokin ve Büyüme Faktörlerinin ELISA ile Validasyonu 80 4.3. MCF-7 Hücrelerinde Genotoksik Stres Aracılı Otofaji ve Otofajik Sekretomun NK Hücrelerinin Anti-tümör İmmün Cevabına Etkileri 81 4.3.1. MCF-7 Hücrelerinde Genotoksik Stres’in CD155 Ligandına Etkisi 81 4.3.2. Otofajik Sekretomla Muamele Edilen DNAM1-NK92 ve Kontrol-NK92 Hücrelerinin MCF-7 Hücrelerini Hedefleme Kapasitesinin Analizi 82 4.3.3. Otofajik Sekretomla Muamele Edilen DNAM1-NK92 ve Kontrol-NK92 Hücrelerinde DNAM1 İfadesinin Flow Sitometri ile Analizi 91 TARTIŞMA 93 5.1. MCF-7 Hücrelerinde Kemoterapi Aracılı Otofaji İndüksiyonu 94 5.2. MCF-7 Hücrelerinde Kemoterapi İndüklü Otofajik Sekretom 95 5.3. Kemoterapi İndüklü Otofaji ve Otofajik Sekretomun DNAM1-NK92 Hücreleri Üzerindeki Etkisi 99 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 103 KAYNAKLAR 105 BİLİMSEL ETİK BEYANI 120 ÖZ GEÇMİŞ 12

Therapy Induced Senescence Promote Expression of Death Receptors in Breast Cancer Cells

Chemotherapeutic agents that cause DNA damage also induce cellular senescence known as therapy-induced senescence (TIS). Cells undergoing senescence may exert detrimental effects by promoting tumor progression in healthy cells or supporting metastases in cancer cells due to senesence-associated secretory phenotype (SASP), involving secretion of chemokines, cytokines, metalloproteinases, and growth factors. Death receptors belong to the tumor necrosis factor receptor superfamily and implicated in induction of apoptosis via activation of extrinsic pathway. The most recognized death receptors are FAS (CD95), TNFR1 and TRAIL-R1 %252F 2 (DR4-DR5) etc. and capable of directly inducing apoptosis in the cell. In this study we aim to investigate the expression of cell death receptors in response to TIS of breast cancer cells for their potential use in elimination of senescent cells. Doxorubicin and etoposide were used to induce senescence selectively in MCF7 breast cancer cell line. Senescence induction was confirmed by beta%253B-galactosidase staining and cell cycle analysis. Activations of p53, p21, and gamma%253B-H2AX and expression levels of cell death receptors (FAS (CD95), TNFR1-2 and DR5 were tested by western blot analysis. Apoptosis was measured by Annexin V%252F7AAD analysis. Here, we show that chemotherapy agents etoposide and doxorubicin induced senescence by arresting MCF-12A and MCF-7 cells in G1 and G2%252FM phases of cell cycle., respectively. In addition, Induction of senescence is confirmed by SA-beta%253B-gal staining and by activation of g-H2AX, p53 and p21 proteins. Neither etoposide nor doxorubicin induced significant apoptosis in MCF12A or MCF-7 cells. Importantly, TIS increased the protein levels of TNFR1, TNFR2 and DR5 receptors selectively in MCF-7 cells but not in MCF-12A cells. These data suggest that chemotherapy agents induce senescence increased the expression of death receptors in breast cancer cell line MCF-7 thus provide a basis for further investigation of death receptor mediated targeting of senescent cells as potential therapeutic strategy

Doğal Öldürücü (Natural Killer: NK) Hücreler ve Kanser İmmunoterapisi

Doğal öldürücü hücreler (Natural Killer%253A NK) birçok aktivatör ve inhibitör reseptörlere sahip olan CD3- CD56%2B lenfositlerdir. NK hücrelerinin kanser tedavisine yönelik olarak otolog ve allojenik kullanımları söz konusudur. Bunun yanı sıra ticari olarak elde edilen NK hücreleri ve bazı kaynaklardan (kordon kanı ve kemik iliği hematopoietik kök hücreleri, embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPS)) farklılaştırılarak elde edilen NK hücreleri de kanser tedavisinde kullanılmaktadır. NK hücre bazlı immünoterapinin, kanser tedavisine yönelik etkin bir tedavi yaklaşımı oluşturabileceği yapılan çalışmalar ile desteklenmektedir. Derlemede pankreas, over, prostat, akciğer, kolon ve meme kanserleri yanısıra glioma ile ilgili NK hücre bazlı immünoterapi çalışmalarına yer verilmiştir

Adipoz doku kökenli mezenkimal kök hücrelerden farklılaştırılan doğal öldürücü hücrelerin pankreas kanseri kök hücreleri ile ko-kültürü sonrasında potansiyal anti-kanser etkinliğinin incelenmesi

Pankreas kanseri (PaCa) %3-5'lik 5 yıllık sağkalım oranı ve yaklaşık 6 aylık yaşam süresi ile en öldürücü insan kanser türlerinden birisidir. MKH'ler in vitro çoğaltılmaya elverişli hücrelerdir. Genellikle invaziv olmayan cerrahi işlemlerle kolay ve bol miktarda elde edilebilen adipoz doku, zengin bir MKH kaynağıdır. Doğal öldürücü (Natural killer:NK) hücreler malignansi veenfeksiyon durumunda konak immünitesinde önemli rol oynayan hücrelerdir. NK hücrelerinin güçlü antitümör yanıtlara aracılık ettiği yapılan birçok çalışma ile gösterilmiştir. Çalışmamızda; ticari olarak elde edilen adipojenik mezankimal kök hücreler (AD-MKH) yeterli konfluent duruma gelen kadar önerilen kültür ortamında kültüre edildi. Kültüre edilen AD-MKH'e hematopoietik indüksiyon yapılarak hematopoietik hücre özellikleri kazandırıldı. Hematopoietik indüksiyon yapılan hücreler natural killer (NK) hücrelere diferansiye edildi. Elde edilen NK hücrelerinin karakterizasyonu CD314 adlı antikor kullanılarak immünohistokimyasal analizlerle belirlenirken, NK hücrelerinde eksprese olan genlerin ekspresyon analizleri ise RT-PCR ile belirlendi. NK hücrelerinin pankreas kanseri üzerindeki apoptotik etkinliği TUNEL yöntemi ile belirlenirken, pankreas kanserinden sorumlu olduğu bilinen genler üzerindeki inhibe edici etkisi de RT-PCR analizi ile gen ekspresyonu düzeylerindeki değişim belirlenerek incelendi. Sonuç olarak ADMKH'den hematopoietik indüksiyon ve diferansiyasyon yolu ile NK hücrelerinin elde edilebileceği ve pankreas kanserinde etkili olabileceği in vitro olarak gösterilmiştir ve ileride klinik kullanım için önerilebileceği sonucuna varılmıştır.Pancreaticcancer (PaCa) is one of the most lethal human cancers with a 5-year survival rate of 3–5 % (approximately 6 monthssurvive). Mesenchymal stem cells are cells which can be proliferated in vitro. Adipose tissue is a rich source of MSCs and it can be usually obtained by a non-invasive surgical procedure easily and abundantly. Natural killer (NK) cells are critical mediators of host immunity against malignancy and infection and its potential in mediating anti-tumor responses has been shown by many studies. In our study; commercially available AD-MSCs were cultured in recommended culture media untill it reached to confluency. Cultured ADMSCs gained hematopoietic characteristics after hematopoietic induction and then were differantiated to NK cells. NK cells obtained were characterised by immunohistochemical analysis via labeling the cells with CD314/NKG2D antibody and NK-specific gene expression analysis were determined by RT-PCR. While the apoptotic activity of NK cells on PaCa cells was determined by TUNEL assays, its inhibitory effect on expression levels of genes which were known to be responsible of pancreas cancer were investigated by RT-PCR analysis by determining the alterations in gene expression levels. In conclusion, NK cells were obtained by hematopoietic induction and then differentiation from ADMSCs its effect on pancreatic cancer was shown in vitro and it can be recommended for further clinical aplications