In vitro culture of ovine mammary gland cells expressing beta-lactoglobulin and beta-casein

The expression of milk proteins in vitro is essential to exploit the mammary gland cells as a biological model. Enzymatic tissue disaggregation has been widely used to establish mammary cell culture, but its effect in long-term ovine mammary cell culture is not completely elucidated. This study aimed at comparing mechanical/enzymatic and mechanical dissociation methods to establish ovine mammary cell culture. We compared cellular differentiation induced by lactating ewe sérum or fetal bovine serum based on the gene expression levels of milk proteins (beta-lactoglobulin, alpha s1-casein, and betacasein). Mechanically dissociated cells were positive immunostaining for cytokeratin 8.13, such as mammary epithelial cells. These cells are responsible for milk protein expression and they are low immunostaining for vimentin, mesenchymal marker. Mechanical/enzymatic dissociation cells were positive for vimentin. The fastest cell growth (cell/hour) was observed in the mechanical dissociation group cultured with 10% fetal bovine serum medium. Mechanically and mechanically/enzymatically derived cells were able to express beta-casein and beta-lactoglobulin, but not alpha s1-casein. The relative expression of beta-lactoglobulin was not affected by the tissue dissociation method or culture media, beta-casein relative expression was down regulated in mechanically dissociated cells cultured in the presence of lactating ewe serum, (P = 0.019). Beta-casein relative expression was also down regulated in mechanically/enzymatically dissociated cells cultured with fetal bovine sérum (P = 0.021). In the present conditions, we conclude that mechanical dissociation followed by culture with 10% of fetal bovine serum was the most efficient method to induce milk proteins’ mRNA expression by ovine mammary epithelial cells in vitro.A expressão in vitro de proteínas do leite e essencial para explorar as células da glândula mamaria como um modelo biológico. A desagregação tecidual via enzimática e amplamente utilizada para o estabelecimento cultivo de células mamarias. No entanto, seu efeito a longo prazo no cultivo de células da glândula mamaria ovina ainda não e bem elucidado. Este estudo tem como objetivo comparar dois métodos de dissociação tecidual, mecânico/enzimático e mecânico, para estabelecer cultivo celular de glândula mamaria ovina. A indução da diferenciação celular, por adição de soro de ovelha lactante ou soro fetal bovino, foi avaliada pelos níveis de expressão de proteínas do leite (beta-lactoglobulina, alpha s1-caseina e beta-caseína). Células mecanicamente dissociadas foram positivamente marcadas para a presença de citoqueratina 8.13, marcador para células epiteliais mamarias. Essas células são as responsáveis pela produção das proteínas do leite e são pouco marcadas para a presença de vimentina, marcador para células de origem mesenquimal. Já as células obtidas da dissociação mecânica/ enzimática foram positivamente marcadas para presença de vimentina. A maior velocidade de crescimento (células/hora) foi observado para o grupo com dissociação mecânica cultivado em meio com 10% de soro fetal bovino. As células obtidas tanto da dissociação mecânica quanto mecânica/enzimática foram capazes de expressar beta-lactoglobulina e beta-caseína, mas não alfa s1-caseina. A expressão relativa de beta-lactoglobulina não foi afetada pelo método de dissociação ou meio de cultivo. A expressão relativa da beta-caseína foi negativamente regulada para células mecanicamente dissociadas e cultivadas na presença de soro de ovelha lactante (P = 0,019). A expressão relativa da beta-caseína também foi negativamente regulada para células dissociadas de forma mecânica/enzimática e cultivadas com soro fetal bovino (P = 0,021). Nas condições do presente estudo, concluímos que o método de dissociação mecânica seguido pelo cultivo em meio com 10% de soro fetal bovino foi o método mais eficiente para induzir a expressão mRNA de proteínas do leite por células epiteliais mamarias ovinas in vitro

Co-cultivo de zigotos e embriões de duas células de camundongos (Mus musculus domesticus) em suspensão de células epiteliais de ovidutos de camundongos e bovinos nos meios CZB sem glicose, TCM199 e Ménézo B2

Zigotos e embriões de 2 células de camundongos F1 (C57/DBA) foram cultivados (controle) e co-cultivados em suspensões de células epiteliais de ovidutos de camundongos (MOEC) e de bovinos (BOEC) até o estádio de blastocistos nos meios CZB, TCM199 e Ménézo B2. Os zigotos que atingiram os estádios de blastocistos expandido e eclodido no CZB foram 44 (38,26%) para o controle, 2 (1,89%) para as MOEC e 8 (6,72%) para as BOEC, sendo que o controle apresentou-se estatisticamente diferente (p;0,05) entre os três grupos. No B2, o total de blastocistos foi de 28 (24,78%) para o controle, 34 (28,10%) para as MOEC e 25 (23,81%) para as BOEC, não havendo diferença estatística (p>;0,05) entre os três grupos. Concluiu-se que o bloqueio dos zigotos nos meios TCM199 e B2 pode estar relacionado à presença da glicose e que o oviduto não é espécie-específico quanto a sua capacidade em promover o desenvolvimento de embriões de camundongos

Superovulação de novilhas da raça Nelore com diferentes doses de FSH/LH e congelação de embriões pelo método one-step com etilenoglicol

Este trabalho teve como objetivo identificar a dose mais eficiente de FSH/LH (300, 400 e 500 UI) no tratamento superovulatório de novilhas da raça Nelore, assim como avaliar o método one-step no processo de congelação de embriões. A variação da resposta superovulatória tem sido muito grande, o que explica o interesse de diversos pesquisadores em encontrar novos hormônios, doses e momentos para realizar a estimulação ovariana. Foram empregadas doses de 300 (n = 20), 400 (n = 21) ou 500 UI (n = 21) de FSH/LH, iniciando-se no décimo dia do ciclo estral, em 8 aplicações decrescentes, durante quatro dias consecutivos. Foi aplicado PGF2alfa concomitante com a quinta subdose de FSH/LH e realizadas duas inseminações artificiais às 12 e às 24 horas após o início dos sintomas de estro. As colheitas dos embriões foram realizadas 6,5 dias após a primeira inseminação artificial. Pelo exame ultra-sonográfico, avaliaram-se os números de folículos no momento da inseminação artificial (15,12; 15,76; e 14,94) e de corpos lúteos (10,68; 11,55; e 10,81) no dia da colheita, encontrando 5,20; 1,81; e 2,76 embriões viáveis, respectivamente, para 300 UI, 400 UI e 500 UI de FSH/LH. O grupo de 300 UI de FSH/LH apresentou os melhores resultados em relação aos embriões viáveis. Dos 106 embriões congelados pelo método one-step em 1,5 M de etilenoglicol e transferidos pelo método não-cirúrgico, 8 resultaram em prenhez (7,5%). A dose de 300 UI de FSH/LH apresentou melhor resposta superovulatória em comparação com as de 400 e 500 UI para novilhas da raça Nelore. A transferência de embriões Bos taurus indicus congelados pelo método one-step em 1,5 M de etilenoglicol não foi eficiente