Theme and variations: evolutionary diversification of the HET-s functional amyloid motif

International audienceIn mammals and fungi, Nod-like receptors (NLR) activate downstream cell death execution proteins by a prion-like mechanism. In Podospora anserina, the NWD2 NLR activates the HET-S Helo-domain pore-forming protein by converting its prion-forming domain into a characteristic β-solenoid amyloid fold. The amyloid forming region of HET-S/s comprises two repetitions of a 21 amino acid motif. Herein, we systematically analyze the sequences of C-terminal regions of fungal HeLo and HeLo-like domain proteins to identify HET-s-related amyloid motifs (HRAM). We now identify four novel HRAM subfamilies in addition to the canonical HET-S/s subfamily. These novel motifs share the pseudo-repeat structure of HET-S/s and a specific pattern of distribution of hydrophobic and polar residues. Sequence co-variance analyses predict parallel in-register β-stacking of the two repeats and residue-residue interactions compatible with the β-solenoid fold. As described for HET-S, most genes encoding the HeLo proteins are adjacent to genes encoding NLRs also displaying HRAMs. The motifs of the NLRs are similar to those of their cognate HeLo-domain protein, indicating concerted evolution between repeats. This study shows that HET-s-related amyloid motifs are more common than anticipated and that they have diversified into discrete subfamilies that apparently share a common overall fold. Amyloids are self-templating protein polymers assembled by stacking of β-strands 1. Amyloid formation is often associated with disease, in particular neurodegenerative age-related pathologies such as Alzheimer's or Parkinson's diseases or other conditions like type 2 diabetes 2,3. Amyloid formation has also been linked to cancer with a proposed role of p53 amyloids in tumorogenesis 4. Yet, amyloids also fulfill a range of different functions inside and outside cells 5–7. Such so-called functional amyloids are involved in hormone and toxin storage and release, formation of cell surface structures in microorganisms and scaffolding of pigment synthesis. A role in the regulation of cell states is also described in yeast, where prion amyloids behave as epigenetic regulatory switches 8. Recently, it has also been reported that functional amyloids play a role in cell fate controlling sig-naling cascades both in mammals and fungi. In mammals, the RIP1 and RIP3 kinases which control the necroptosis cell death pathway form an amyloid-like complex assembled via short conserved motifs termed RHIM (for RIP homotypic interaction motifs)

Signal Transduction by a Fungal NOD-Like Receptor Based on Propagation of a Prion Amyloid Fold

In the fungus Podospora anserina, the [Het-s] prion induces programmed cell death by activating the HET-S pore-forming protein. The HET-s β-solenoid prion fold serves as a template for converting the HET-S prion-forming domain into the same fold. This conversion, in turn, activates the HET-S pore-forming domain. The gene immediately adjacent to het-S encodes NWD2, a Nod-like receptor (NLR) with an N-terminal motif similar to the elementary repeat unit of the β-solenoid fold. NLRs are immune receptors controlling cell death and host defense processes in animals, plants and fungi. We have proposed that, analogously to [Het-s], NWD2 can activate the HET-S pore-forming protein by converting its prion-forming region into the β-solenoid fold. Here, we analyze the ability of NWD2 to induce formation of the β-solenoid prion fold. We show that artificial NWD2 variants induce formation of the [Het-s] prion, specifically in presence of their cognate ligands. The N-terminal motif is responsible for this prion induction, and mutations predicted to affect the β-solenoid fold abolish templating activity. In vitro, the N-terminal motif assembles into infectious prion amyloids that display a structure resembling the β-solenoid fold. In vivo, the assembled form of the NWD2 N-terminal region activates the HET-S pore-forming protein. This study documenting the role of the β-solenoid fold in fungal NLR function further highlights the general importance of amyloid and prion-like signaling in immunity-related cell fate pathways

The [Het-s] Prion, an Amyloid Fold as a Cell Death Activation Trigger

International audienc

Amyloid folds with prion or prion-like features as signal transducing elements in filamentous fungi

Les prions sont des agrégats amyloïdes infectieux. Le prion [Het-s] de Podospora anserina est un des prions le mieux caractérisé. Le prion [Het-s] est impliqué dans l’incompatibilité végétative – un processus biologique qui a lieu au cours des anastomoses entre des souches génétiquement différentes. Quand une souche [Het-s] fusionne avec une souche exprimant l’allèle alternatif du gène het-s – l’allèle het-S – une réaction de mort cellulaire programmée est déclenchée. Les deux protéines diffèrent de 13 acides aminés et partagent une architecture en deux domaines ; un domaine globulaire en N-terminal nommé HeLo et un domaine PFD (Prion Forming Domain) en C-terminal. Il a été établi qu’en présence des fibres amyloïdes de [Het-s], la protéine HET-S agit en ‘pore-forming’ toxine : la transconformation du PFD de HET-S par les fibres amyloïdes du [Het-s] active le domaine HeLo de HET-S et entraîne la mort cellulaire. Afin de mieux caractériser les propriétés du repliement β-solénoïde du prion [Het-s], nous avons entrepris l’exploration in vivo des relations structure-fonction de ce repliement par une approche d’alanine scanning. Au cours de nos recherches pour des homologues de HET-S/s, nous avons identifié un partenaire fonctionnel de HET-S – une protéine appelée NWD2. NWD2 est une protéine STAND et partage une séquence homologue (3-23) au PFD de HET-S/s. Les protéines STAND, après la reconnaissance d’un ligand, forment des plateformes oligomériques pour transduire le signal. Des analyses génomiques in silico réalisées dans plusieurs génomes fongiques nous ont amené à proposer que la transduction du signal via une protéine STAND à repliement amyloïde est un mécanisme ancien et conservé chez les champignons. Dans ce contexte nous avons identifié deux nouveaux motifs PFD putatifs – σ et PP. En soumettant à l’épreuve notre hypothèse, nous avons d’abord démontré que NWD2 interagit avec HET-S/s en fonction d’un ligand spécifique in vivo et l’interaction est dépendante de la séquence NWD2(3-23) homologue au PFD de HET-S/s. Nous avons ensuite exploré le motif PP associé à un domaine HeLo-like (HELL) dans le génome de Chaetomium globosum. En démontrant la nature amyloïde et prion-like du motif PP ainsi que l’analogie fonctionnelle entre ce motif et le PFD de HET-S/s in vivo nous avons apporté des arguments supplémentaires en faveur de l’implication des repliements amyloïdes dans la transduction du signal chez les champignons filamenteux.Prions are infectious amyloid aggregates. Podospora anserina’s [Het-s] is one of the best characterized fungal prions with a remarkably high prevalence in wild populations. [Het-s] functions in vegetative incompatibility - a biological process occurring during anastomosis between two genetically incompatible strains. When an [Het-s] prion infected strain fuses with a strain expressing the alternative allelic variant of the het-s locus – het-S – a cell death reaction of the heterokaryon occurs. Differing by 13 amino acids both proteins shares two domain architecture; a globular N-terminal domain called HeLo and a C-terminal Prion Forming Domain (PFD). It has been demonstrated that in presence of [Het-s] amyloid fibers HET-S turns into a pore-forming toxin: transconformation of the HET-S PFD by [Het-s] fibers triggers the refolding of the HET-S HeLo domain, inducing the cell death reaction. In an attempt to better characterize the conserved features of the [Het-s] β-solenoid fold we have used a mutational alanine scanning approach and explored in vivo the existing relations between structure and prion functions of [Het-s]. During our quest for new distant homologues of HET-S/s, we have identified a functional partner of HET-S toxin called NWD2. NWD2 is a STAND protein and shares a homology sequence (3-23) in the HET-S/s PFD. STAND proteins form signal transducing hubs through oligomerization upon ligand recognition. Several in silico analysis in various fungal genomes led us to propose that signal transduction via a STAND protein using an amyloid prion-like fold is a general widespread mechanism in fungi. In that context, we have proposed two novel putative PFD motifs called σ and PP. Testing experimentally our hypothesis, we have first demonstrated that NWD2 interacts with HET-S/s upon ligand recognition in vivo and the interaction is dependant of the NWD2(3-23) region. We have then explored the newly identified putative prion domain PP, associated to a Helo-like domain (termed HELL) from the filamentous fungus Chaetomium globosum. By demonstrating the amyloid, prion-like nature of the PP motif and the functional analogy between PP and HET-S/s PFD domain in vivo, we expose further evidences supporting the implication of amyloid folds in signal transduction in filamentous fungi

Amyloid folds with prion or prion-like features as signal transducing elements in filamentous fungi

Les prions sont des agrégats amyloïdes infectieux. Le prion [Het-s] de Podospora anserina est un des prions le mieux caractérisé. Le prion [Het-s] est impliqué dans l’incompatibilité végétative – un processus biologique qui a lieu au cours des anastomoses entre des souches génétiquement différentes. Quand une souche [Het-s] fusionne avec une souche exprimant l’allèle alternatif du gène het-s – l’allèle het-S – une réaction de mort cellulaire programmée est déclenchée. Les deux protéines diffèrent de 13 acides aminés et partagent une architecture en deux domaines ; un domaine globulaire en N-terminal nommé HeLo et un domaine PFD (Prion Forming Domain) en C-terminal. Il a été établi qu’en présence des fibres amyloïdes de [Het-s], la protéine HET-S agit en ‘pore-forming’ toxine : la transconformation du PFD de HET-S par les fibres amyloïdes du [Het-s] active le domaine HeLo de HET-S et entraîne la mort cellulaire. Afin de mieux caractériser les propriétés du repliement β-solénoïde du prion [Het-s], nous avons entrepris l’exploration in vivo des relations structure-fonction de ce repliement par une approche d’alanine scanning. Au cours de nos recherches pour des homologues de HET-S/s, nous avons identifié un partenaire fonctionnel de HET-S – une protéine appelée NWD2. NWD2 est une protéine STAND et partage une séquence homologue (3-23) au PFD de HET-S/s. Les protéines STAND, après la reconnaissance d’un ligand, forment des plateformes oligomériques pour transduire le signal. Des analyses génomiques in silico réalisées dans plusieurs génomes fongiques nous ont amené à proposer que la transduction du signal via une protéine STAND à repliement amyloïde est un mécanisme ancien et conservé chez les champignons. Dans ce contexte nous avons identifié deux nouveaux motifs PFD putatifs – σ et PP. En soumettant à l’épreuve notre hypothèse, nous avons d’abord démontré que NWD2 interagit avec HET-S/s en fonction d’un ligand spécifique in vivo et l’interaction est dépendante de la séquence NWD2(3-23) homologue au PFD de HET-S/s. Nous avons ensuite exploré le motif PP associé à un domaine HeLo-like (HELL) dans le génome de Chaetomium globosum. En démontrant la nature amyloïde et prion-like du motif PP ainsi que l’analogie fonctionnelle entre ce motif et le PFD de HET-S/s in vivo nous avons apporté des arguments supplémentaires en faveur de l’implication des repliements amyloïdes dans la transduction du signal chez les champignons filamenteux.Prions are infectious amyloid aggregates. Podospora anserina’s [Het-s] is one of the best characterized fungal prions with a remarkably high prevalence in wild populations. [Het-s] functions in vegetative incompatibility - a biological process occurring during anastomosis between two genetically incompatible strains. When an [Het-s] prion infected strain fuses with a strain expressing the alternative allelic variant of the het-s locus – het-S – a cell death reaction of the heterokaryon occurs. Differing by 13 amino acids both proteins shares two domain architecture; a globular N-terminal domain called HeLo and a C-terminal Prion Forming Domain (PFD). It has been demonstrated that in presence of [Het-s] amyloid fibers HET-S turns into a pore-forming toxin: transconformation of the HET-S PFD by [Het-s] fibers triggers the refolding of the HET-S HeLo domain, inducing the cell death reaction. In an attempt to better characterize the conserved features of the [Het-s] β-solenoid fold we have used a mutational alanine scanning approach and explored in vivo the existing relations between structure and prion functions of [Het-s]. During our quest for new distant homologues of HET-S/s, we have identified a functional partner of HET-S toxin called NWD2. NWD2 is a STAND protein and shares a homology sequence (3-23) in the HET-S/s PFD. STAND proteins form signal transducing hubs through oligomerization upon ligand recognition. Several in silico analysis in various fungal genomes led us to propose that signal transduction via a STAND protein using an amyloid prion-like fold is a general widespread mechanism in fungi. In that context, we have proposed two novel putative PFD motifs called σ and PP. Testing experimentally our hypothesis, we have first demonstrated that NWD2 interacts with HET-S/s upon ligand recognition in vivo and the interaction is dependant of the NWD2(3-23) region. We have then explored the newly identified putative prion domain PP, associated to a Helo-like domain (termed HELL) from the filamentous fungus Chaetomium globosum. By demonstrating the amyloid, prion-like nature of the PP motif and the functional analogy between PP and HET-S/s PFD domain in vivo, we expose further evidences supporting the implication of amyloid folds in signal transduction in filamentous fungi

Repliements amyloïdes à propriétés prion dans la transduction du signal chez les champignons filamenteux

Les prions sont des agrégats amyloïdes infectieux. Le prion [Het-s] de Podospora anserina est un des prions le mieux caractérisé. Le prion [Het-s] est impliqué dans l incompatibilité végétative un processus biologique qui a lieu au cours des anastomoses entre des souches génétiquement différentes. Quand une souche [Het-s] fusionne avec une souche exprimant l allèle alternatif du gène het-s l allèle het-S une réaction de mort cellulaire programmée est déclenchée. Les deux protéines diffèrent de 13 acides aminés et partagent une architecture en deux domaines ; un domaine globulaire en N-terminal nommé HeLo et un domaine PFD (Prion Forming Domain) en C-terminal. Il a été établi qu en présence des fibres amyloïdes de [Het-s], la protéine HET-S agit en pore-forming toxine : la transconformation du PFD de HET-S par les fibres amyloïdes du [Het-s] active le domaine HeLo de HET-S et entraîne la mort cellulaire. Afin de mieux caractériser les propriétés du repliement b-solénoïde du prion [Het-s], nous avons entrepris l exploration in vivo des relations structure-fonction de ce repliement par une approche d alanine scanning. Au cours de nos recherches pour des homologues de HET-S/s, nous avons identifié un partenaire fonctionnel de HET-S une protéine appelée NWD2. NWD2 est une protéine STAND et partage une séquence homologue (3-23) au PFD de HET-S/s. Les protéines STAND, après la reconnaissance d un ligand, forment des plateformes oligomériques pour transduire le signal. Des analyses génomiques in silico réalisées dans plusieurs génomes fongiques nous ont amené à proposer que la transduction du signal via une protéine STAND à repliement amyloïde est un mécanisme ancien et conservé chez les champignons. Dans ce contexte nous avons identifié deux nouveaux motifs PFD putatifs et PP. En soumettant à l épreuve notre hypothèse, nous avons d abord démontré que NWD2 interagit avec HET-S/s en fonction d un ligand spécifique in vivo et l interaction est dépendante de la séquence NWD2(3-23) homologue au PFD de HET-S/s. Nous avons ensuite exploré le motif PP associé à un domaine HeLo-like (HELL) dans le génome de Chaetomium globosum. En démontrant la nature amyloïde et prion-like du motif PP ainsi que l analogie fonctionnelle entre ce motif et le PFD de HET-S/s in vivo nous avons apporté des arguments supplémentaires en faveur de l implication des repliements amyloïdes dans la transduction du signal chez les champignons filamenteux.Prions are infectious amyloid aggregates. Podospora anserina s [Het-s] is one of the best characterized fungal prions with a remarkably high prevalence in wild populations. [Het-s] functions in vegetative incompatibility - a biological process occurring during anastomosis between two genetically incompatible strains. When an [Het-s] prion infected strain fuses with a strain expressing the alternative allelic variant of the het-s locus het-S a cell death reaction of the heterokaryon occurs. Differing by 13 amino acids both proteins shares two domain architecture; a globular N-terminal domain called HeLo and a C-terminal Prion Forming Domain (PFD). It has been demonstrated that in presence of [Het-s] amyloid fibers HET-S turns into a pore-forming toxin: transconformation of the HET-S PFD by [Het-s] fibers triggers the refolding of the HET-S HeLo domain, inducing the cell death reaction. In an attempt to better characterize the conserved features of the [Het-s] b-solenoid fold we have used a mutational alanine scanning approach and explored in vivo the existing relations between structure and prion functions of [Het-s]. During our quest for new distant homologues of HET-S/s, we have identified a functional partner of HET-S toxin called NWD2. NWD2 is a STAND protein and shares a homology sequence (3-23) in the HET-S/s PFD. STAND proteins form signal transducing hubs through oligomerization upon ligand recognition. Several in silico analysis in various fungal genomes led us to propose that signal transduction via a STAND protein using an amyloid prion-like fold is a general widespread mechanism in fungi. In that context, we have proposed two novel putative PFD motifs called and PP. Testing experimentally our hypothesis, we have first demonstrated that NWD2 interacts with HET-S/s upon ligand recognition in vivo and the interaction is dependant of the NWD2(3-23) region. We have then explored the newly identified putative prion domain PP, associated to a Helo-like domain (termed HELL) from the filamentous fungus Chaetomium globosum. By demonstrating the amyloid, prion-like nature of the PP motif and the functional analogy between PP and HET-S/s PFD domain in vivo, we expose further evidences supporting the implication of amyloid folds in signal transduction in filamentous fungi.BORDEAUX2-Bib. électronique (335229905) / SudocBORDEAUX1-Bib.electronique (335229901) / SudocSudocFranceF

Genomic Clustering and Homology between HET-S and the NWD2 STAND Protein in Various Fungal Genomes

Background: Prions are infectious proteins propagating as self-perpetuating amyloid polymers. The [Het-s] prion of Podospora anserina is involved in a cell death process associated with non-self recognition. The prion forming domain (PFD) of HET-s adopts a b-solenoid amyloid structure characterized by the two fold repetition of an elementary triangular motif. [Het-s] induces cell death when interacting with HET-S, an allelic variant of HET-s. When templated by [Het-s], HET-S undergoes a trans-conformation, relocates to the cell membrane and induces toxicity. Methodology/Principal Findings: Here, comparing HET-s homologs from different species, we devise a consensus for the HET-s elementary triangular motif. We use this motif to screen genomic databases and find a match to the N-terminus of NWD2, a STAND protein, encoded by the gene immediately adjacent to het-S. STAND proteins are signal transducing ATPases which undergo ligand-induced oligomerisation. Homology modelling predicts that the NWD2 N-terminal region adopts a HET-s-like fold. We propose that upon NWD2 oligomerisation, these N-terminal extensions adopt the b-solenoid fold and template HET-S to adopt the amyloid fold and trigger toxicity. We extend this model to a putative prion, the s infectious element in Nectria haematococca, because the s locus controlling propagation of s also encodes a STAND protein and displays analogous features. Comparative genomic analyses indicate evolutionary conservation of these STAND/prionlike gene pairs, identify a number of novel prion candidates and define, in addition to the HET-s PFD motif, two distinct