Nuevos métodos de caracterización y activación de geles de agarosa como soportes para la inmovilización de proteínas de interés industrial

Los geles de agarosa, son soportes muy hidrofilicos e inertes. La agarosa esta constituida por fibras gruesas que para la mayoría de las proteínas (en función de su tamaño) semeja una superficie plana contra la cual interaccionan. En esta tesis doctoral se pretende aprovechar las ventajas de la agarosa (derivadas de su morfología) frente a otros soportes, al mismo tiempo que se establecen estrategias que permiten superar los inconvenientes. El acoplamiento proteína-superficie plana presenta ventajas a la hora de realizar procesos de inmovilización multipuntual, pudiendo diseñar inmovilizaciones dirigidas de proteínas poliméricas, o metodos de enmascaramiento de determinadas áreas de proteínas. Si bien el empleo de un soporte tipo superficie como la agarosa, conlleva también algunas desventajas: tales como impedimentos estericos que dificultan el acceso de ligando o sustratos macromoleculares que tienen que actuar con proteínas o enzimas. También, la morfología tipo superficie plana puede dar lugar a interacciones no especificas que pueden complicar los procesos de purificación de proteína

Proof of concept of using a membrane-sensing peptide for sEVs affinity-based isolation

Introduction: One main limitation in biomarker studies using EVs is the lack of a suitable isolation method rendering high yield and purity samples in a quick and easily standardized procedure. Here we report an affinity isolation method with a membrane-sensing peptide (MSP) derived from bradykinin. Methods: We designed a protocol based on agarose beads carrying cation chelates to specifically bind to the 6His-tagged membrane-sensing peptide. This approach presents several advantages: 1) cation-carrying agaroses are widely used and standardized for His-tagged protein isolation, 2) the affinity protocol can be performed in small volumes, feasible and manageable for clinical routine and 3) elution with imidazole or EDTA allows a gentle and easy recovery without EV damage, facilitating subsequent characterization and functional analyses. Results: The optimized final procedure incubates 0.5 mg of peptide for 10 min with 10 µL of Long-arm Cobalt agarose before an overnight incubation with concentrated cell conditioned medium. EV downstream analyses can be directly performed on the agarose beads adding lysis or nucleic-acid extraction buffers, or gently eluted with imidazole or EDTA, rendering a fully competent EV preparation. Discussion: This new isolation methodology is based on the recognition of general membrane characteristics independent of surface markers. It is thus unbiased and can be used in any species EV sample, even in samples from animal or plant species against which no suitable antibodies exist. Being an affinity method, the sample handling protocol is very simple, less time-consuming, does not require specialized equipment and can be easily introduced in a clinical automated routine. We demonstrated the high purity and yield of the method in comparison with other commercially available kits. This method can also be scale up or down, with the possibility of analyzing very low amounts of sample, and it is compatible with any downstream analyses thanks to the gentle elution procedureThis work has been supported by grants PID 2020-119627GB-I00 and DTS21/00134 from Ministerio Español de Ciencia e Innovación (Spain) from to MY-M. BB is supported by predoctoral industrial contract IND2019_BMD-17100 and JM by a INV-CAM-03 Yo Investigo contract, both from Comunidad Autónoma de Madrid. Work was partially funded from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under grant agreements No. 951768 (project MARVEL

Optimization of extracellular vesicle isolation and their separation from lipoproteins by size exclusion chromatography

Abstract Interest in the use of extracellular vesicles (EVs) as biomarkers of disease is rapidly growing. However, one main unsolved issue in the EV field is finding a technique able to eliminate non‐EV contaminants present in biofluid samples in a one‐step isolation protocol. Due to the expansion and value of size exclusion chromatography (SEC) as one of the best EV isolation methods, we have tested several agarose resins with different agarose percentages, bead sizes and crosslinking features to optimize EV isolation. For this optimization of SEC, we first employed conditioned media from a melanoma cell culture, a simpler sample in comparison to biological fluids, but which also contains abundant contaminants such as soluble protein and lipoproteins (LPPs). The distinct agaroses and the combinations of resins with different agarose percentages in the same column were tested. Soluble protein, EVs and LPPs levels from the different eluted fractions were quantitated by immunodetection or absorbance measurements. Samples were also analysed by NTA and TEM to verify the yield and the LPP contamination. Different percentages of agarose resins (2%, 4% and 6%) yielded samples with increasing LPP contamination respectively, which was not improved in the columns that combined them. Crosslinking of the agarose did not affect EV isolation yield nor the LPP contamination. In contrast, reducing the bead size greatly improved EV purity. We thus selected 4% Rapid Run Fine agarose beads as the resin that more efficiently isolated EVs with almost no contamination of other particles. Using blood plasma samples, this resin also demonstrated an improved capacity in the isolation of EVs from LPPs in comparison to the agaroses most commonly used in the field and differential ultracentrifugation

Jóvenes investigadores en la naturaleza : el huerto, el campo y el río

Seleccionado en la convocatoria: Ayudas a la innovación e investigación educativa en centros docentes de niveles no universitarios, Gobierno de Aragón 2008-09Los alumnos del IES Cinca-Alcanadre realizan proyectos de investigación en el medio natural que les rodea poniendo en práctica el método científico. El aprendizaje se realiza mediante grupos cooperativos a lo largo del curso académico. Las diversas áreas o asignaturas aportan conocimientos para orientar los trabajos de investigación: el departamento de inglés con una investigación bibliográfica y búsqueda de recursos, el área de ciencias sociales en la realización de una maqueta de la zona, el área de educación plástica y visual en la realización de dibujos naturalistas, el departamento de tecnología en la presentación de trabajos y el departamento de orientación en el asesoramiento sobre técnicas de trabajo en grupos cooperativos. Se ha creado un huerto dentro del recinto escolar, donde se ha acondicionado la tierra y se ha seleccionado cultivos en función de la temporada. El mantenimiento del huerto lo llevan a cabo los alumnos de primero de Programa de Aprendizaje Básico, alumnos de Diversificación Curricular y alumnos con dificultades para la integración escolar. También se ha realizado un estudio de la calidad de las aguas del río Cinca con macroinvertebrados acuáticos a través de salidas con los alumnos de cuarto de ESO para explicar el procedimiento y tomar muestras en el río. Los alumnos han presentado sus conclusiones en forma de ponencias científicas en un congreso escolar local durante la semana cultural delante del resto de los compañeros del instituto. Se ha conseguido extender la ciencia al medio natural, con una metodología activa que fomenta el autoaprendizaje y la autonomía personal, así como la motivación de los alumnos y la del profesorado.Gobierno de Aragón. Departamento de Educación, Cultura y DeporteAragónDirección General de Política Educativa; Avda. Gómez Laguna, 25, planta 2; 50009 Zaragoza; Tel. +34976715416; Fax +34976715496ES