Επιγενετικοί μηχανισμοί στη λειτουργία του καρδιαγγειακού συστήματος σε ασθενείς με Δρεπανοκυτταρική Νόσο

Η δρεπανοκυτταρική νόσος οφείλεται σε σημειακή μετάλλαξη στο 6ο κωδικόνιο του γονιδίου της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης Α. Η προκύπτουσα αιμοσφαιρίνη τείνει να πολυμερίζεται υπό συνθήκες υποξίας, προκαλώντας πρόωρη καταστροφή των ερυθρών αιμοσφαιρίων και φαινόμενα αγγειακής απόφραξης στους πάσχοντες. Χαρακτηρίζεται από εκδηλώσεις και επιπλοκές σε πολλά όργανα και ιστούς εκτός αιμοποιητικού συστήματος. Από το καρδιαγγειακό σύστημα, σημαντικότερη επιπλοκή της είναι η πνευμονική υπέρταση. Παράλληλα, χαρακτηρίζεται από κλινική ετερογένεια, που οφείλεται σε περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες: τα τελευταία χρόνια, γονίδια που δε σχετίζονται άμεσα με τη λειτουργία της αιμοποίησης έχουν συσχετισθεί με τη βαρύτητα και τις επιπλοκές της νόσου. Μέχρι σήμερα έχει ερμηνευθεί μόνο ένα πολύ μικρό μέρος αυτής της κλινικής ετερογένειας. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν γονίδια που σχετίζονται με τη λειτουργία του αγγειακού ενδοθηλίου και το οξειδωτικό stress σε επίπεδο πολυμορφισμών ή/και γονιδιακής έκφρασης σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική νόσο. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν πολυμορφισμοί των γονιδίων NOS3 και MTHFR, που κωδικοποιούν τα ένζυμα «ενδοθηλιακή συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου» (eNOS) και «αναγωγάση του μεθυλενοτετραϋδροφυλλικού οξέος» (MTHFR) αντίστοιχα. Παράλληλα, μελετήθηκε η έκφραση σε επίπεδο mRNA των ενζύμων eNOS και SOD2 και των μεταγραφικών παραγόντων HIF-1α και PGC-1α. Για τα δυο πρώτα ένζυμα, μελετήθηκε επιπλέον η κατάσταση μεθυλίωσης των νησιδίων κυτοσίνης-γουανίνης σε ρυθμιστικές περιοχές του DNA των αντίστοιχων γονιδίων. Σε ότι αφορά το σκέλος των πολυμορφισμών, ο γονότυπος CC ως προς τη θέση -786 (T→C) στον υποκινητή του NOS3 συσχετίσθηκε με την εμφάνιση αμφιβληστροειδοπάθειας σε ασθενείς με γονότυπο S/S και β0/S, ενώ στην ίδια ομάδα ασθενών οι γονότυποι GT και TT ως προς τη θέση +894 (G→T) στο εξώνιο 7 του NOS3 συσχετίστηκαν με υψηλότερες τιμές αιματοκρίτη-αιμοσφαιρίνης. Η μελέτη των πολυμορφισμών στις θέσεις +677 (C→T) και +1298 (A→C) στα εξώνια 4 και 7 αντίστοιχα του γονιδίου MTHFR δεν απέδωσε στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις. Η έκφραση του NOS3 δε διέφερε μεταξύ ασθενών και υγιών, ενώ η έκφραση των SOD2, PPARGC1A και HIF1A ήταν σημαντικά μειωμένη στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Μάλιστα, οι ασθενείς με υπερηχοκαρδιογραφικές ενδείξεις πνευμονικής υπέρτασης έτειναν να εμφανίζουν μειωμένη έκφραση του SOD2 σε σχέση με τους υπόλοιπους ασθενείς. Η μελέτη της κατάστασης μεθυλίωσης των ρυθμιστικών αλληλουχιών των γονιδίων NOS3 και SOD2 με την τεχνική MSP (αντίδραση PCR ειδική για μεθυλίωση) ανέδειξε την παρουσία τόσο μεθυλιωμένων όσο και αμεθυλίωτων ομόλογων αλληλουχιών στα λευκοκύτταρα του περιφερικού αίματος. Ετσι, επιβεβαιώνεται ο δυνητικά ρυθμιστικός ρόλος της επιγενετικής αυτής τροποποίησης στην έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων. Ομως, τα ευρήματα αυτά αφορούν εξίσου τόσο τους ασθενείς, όσο και τους υγιείς μάρτυρες. Κατά συνέπεια δεν είναι μόνον αυτά επαρκή για να ερμηνεύσουν τη διαφορά στην έκφραση του SOD2 σε επίπεδο mRNA μεταξύ ασθενών και μαρτύρων.Sickle Cell Disease (SCD) is the most common inherited structural disorder of human hemoglobin. It is caused by a missence mutation on the 6th codon of the beta hemoglobin gene. The resulting form of hemoglobin tends to polymerize under hypoxic conditions, causing premature red blood cell destruction and vascular obstructive episodes. Despite being a hematological disease, clinical manifestations and complications implicate most organs and systems of human body. As far as the cardiovascular system is concerned, pulmonary hypertension is its most common and devastating complication. Moreover, Sickle Cell Disease features high clinical heterogeneity, explained by both genetic and environmental parameters. In the past few years, the function of various genes not exclusively related to hemopoesis has been related to Sickle Cell Disease clinical severity/prognosis, but only a minor part of its heterogeneity has been convincingly interpreted so far. Aim of the present thesis was to study genes related to vascular endothelial function and oxidative stress in patients suffering from Sickle Cell Disease. More specifically, single nucleotide polymorphisms of NOS3 and MTHFR genes, encoding endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) enzymes were studied. Furthermore, expression of genes encoding eNOS and superoxide dismutase 2 (SOD-2) enzymes, as well as HIF-1a and PGC-1a transcription factors, was studied on the mRNA level. Epigenetic regulation was studied on NOS3 and SOD2 genes by determining the methylation status of crucial cytosine-guanine islets on regulatory domains. On the polymorphism level, CC genotype for T→C polymorphism at -786 position of NOS3 promoter was related with sickle cell retinopathy in patients with S/S and β0/S genotype, while GG and GT genotypes for G→T polymorphism at +894 position at exon 7 of the same gene was related with higher hematocrit and hemoglobin values. MTHFR polymorphisms on positions +677 (C→T, exon 4) και +1298 (A→C, exon 7) were not related to clinical course or laboratory values of patients in the present study. NOS3 expression was similar between patients and controls, while SOD2, PPARGC1A and HIF1A expression was significantly lower in Sickle Cell Disease patients. Of interest, patients with echocardiographic markers of pulmonary hypertension featured lower SOD2 expression in comparison to other patients. Methylation study of NOS3 and SOD2 regulatory sequences by MSP (Methylation Specific PCR) revealed the presence of differentially methylated homologous sequences in both patients and controls, thus verifying their regulatory role in gene expression. However, these findings are not sufficient to interpret the difference in SOD2 expression between patients and controls, as both groups exhibited methylated and unmethylated sequence

Epigenetics in cardiovascular function in patients with sickle cell disease

Sickle Cell Disease (SCD) is the most common inherited structural disorder of human hemoglobin. It is caused by a missence mutation on the 6th codon of the beta hemoglobin gene. The resulting form of hemoglobin tends to polymerize under hypoxic conditions, causing premature red blood cell destruction and vascular obstructive episodes. Despite being a hematological disease, clinical manifestations and complications implicate most organs and systems of human body. As far as the cardiovascular system is concerned, pulmonary hypertension is its most common and devastating complication. Moreover, Sickle Cell Disease features high clinical heterogeneity, explained by both genetic and environmental parameters. In the past few years, the function of various genes not exclusively related to hemopoesis has been related to Sickle Cell Disease clinical severity/prognosis, but only a minor part of its heterogeneity has been convincingly interpreted so far. Aim of the present thesis was to study genes related to vascular endothelial function and oxidative stress in patients suffering from Sickle Cell Disease. More specifically, single nucleotide polymorphisms of NOS3 and MTHFR genes, encoding endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) enzymes were studied. Furthermore, expression of genes encoding eNOS and superoxide dismutase 2 (SOD-2) enzymes, as well as HIF-1a and PGC-1a transcription factors, was studied on the mRNA level. Epigenetic regulation was studied on NOS3 and SOD2 genes by determining the methylation status of crucial cytosine-guanine islets on regulatory domains. On the polymorphism level, CC genotype for T→C polymorphism at -786 position of NOS3 promoter was related with sickle cell retinopathy in patients with S/S and β0/S genotype, while GG and GT genotypes for G→T polymorphism at +894 position at exon 7 of the same gene was related with higher hematocrit and hemoglobin values. MTHFR polymorphisms on positions +677 (C→T, exon 4) και +1298 (A→C, exon 7) were not related to clinical course or laboratory values of patients in the present study. NOS3 expression was similar between patients and controls, while SOD2, PPARGC1A and HIF1A expression was significantly lower in Sickle Cell Disease patients. Of interest, patients with echocardiographic markers of pulmonary hypertension featured lower SOD2 expression in comparison to other patients. Methylation study of NOS3 and SOD2 regulatory sequences by MSP (Methylation Specific PCR) revealed the presence of differentially methylated homologous sequences in both patients and controls, thus verifying their regulatory role in gene expression. However, these findings are not sufficient to interpret the difference in SOD2 expression between patients and controls, as both groups exhibited methylated and unmethylated sequences.Η δρεπανοκυτταρική νόσος οφείλεται σε σημειακή μετάλλαξη στο 6ο κωδικόνιο του γονιδίου της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης Α. Η προκύπτουσα αιμοσφαιρίνη τείνει να πολυμερίζεται υπό συνθήκες υποξίας, προκαλώντας πρόωρη καταστροφή των ερυθρών αιμοσφαιρίων και φαινόμενα αγγειακής απόφραξης στους πάσχοντες. Χαρακτηρίζεται από εκδηλώσεις και επιπλοκές σε πολλά όργανα και ιστούς εκτός αιμοποιητικού συστήματος. Από το καρδιαγγειακό σύστημα, σημαντικότερη επιπλοκή της είναι η πνευμονική υπέρταση. Παράλληλα, χαρακτηρίζεται από κλινική ετερογένεια, που οφείλεται σε περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες: τα τελευταία χρόνια, γονίδια που δε σχετίζονται άμεσα με τη λειτουργία της αιμοποίησης έχουν συσχετισθεί με τη βαρύτητα και τις επιπλοκές της νόσου. Μέχρι σήμερα έχει ερμηνευθεί μόνο ένα πολύ μικρό μέρος αυτής της κλινικής ετερογένειας. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν γονίδια που σχετίζονται με τη λειτουργία του αγγειακού ενδοθηλίου και το οξειδωτικό stress σε επίπεδο πολυμορφισμών ή/και γονιδιακής έκφρασης σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική νόσο. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν πολυμορφισμοί των γονιδίων NOS3 και MTHFR, που κωδικοποιούν τα ένζυμα «ενδοθηλιακή συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου» (eNOS) και «αναγωγάση του μεθυλενοτετραϋδροφυλλικού οξέος» (MTHFR) αντίστοιχα. Παράλληλα, μελετήθηκε η έκφραση σε επίπεδο mRNA των ενζύμων eNOS και SOD2 και των μεταγραφικών παραγόντων HIF-1α και PGC-1α. Για τα δυο πρώτα ένζυμα, μελετήθηκε επιπλέον η κατάσταση μεθυλίωσης των νησιδίων κυτοσίνης-γουανίνης σε ρυθμιστικές περιοχές του DNA των αντίστοιχων γονιδίων. Σε ότι αφορά το σκέλος των πολυμορφισμών, ο γονότυπος CC ως προς τη θέση -786 (T→C) στον υποκινητή του NOS3 συσχετίσθηκε με την εμφάνιση αμφιβληστροειδοπάθειας σε ασθενείς με γονότυπο S/S και β0/S, ενώ στην ίδια ομάδα ασθενών οι γονότυποι GT και TT ως προς τη θέση +894 (G→T) στο εξώνιο 7 του NOS3 συσχετίστηκαν με υψηλότερες τιμές αιματοκρίτη-αιμοσφαιρίνης. Η μελέτη των πολυμορφισμών στις θέσεις +677 (C→T) και +1298 (A→C) στα εξώνια 4 και 7 αντίστοιχα του γονιδίου MTHFR δεν απέδωσε στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις. Η έκφραση του NOS3 δε διέφερε μεταξύ ασθενών και υγιών, ενώ η έκφραση των SOD2, PPARGC1A και HIF1A ήταν σημαντικά μειωμένη στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Μάλιστα, οι ασθενείς με υπερηχοκαρδιογραφικές ενδείξεις πνευμονικής υπέρτασης έτειναν να εμφανίζουν μειωμένη έκφραση του SOD2 σε σχέση με τους υπόλοιπους ασθενείς. Η μελέτη της κατάστασης μεθυλίωσης των ρυθμιστικών αλληλουχιών των γονιδίων NOS3 και SOD2 με την τεχνική MSP (αντίδραση PCR ειδική για μεθυλίωση) ανέδειξε την παρουσία τόσο μεθυλιωμένων όσο και αμεθυλίωτων ομόλογων αλληλουχιών στα λευκοκύτταρα του περιφερικού αίματος. Ετσι, επιβεβαιώνεται ο δυνητικά ρυθμιστικός ρόλος της επιγενετικής αυτής τροποποίησης στην έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων. Ομως, τα ευρήματα αυτά αφορούν εξίσου τόσο τους ασθενείς, όσο και τους υγιείς μάρτυρες. Κατά συνέπεια δεν είναι μόνον αυτά επαρκή για να ερμηνεύσουν τη διαφορά στην έκφραση του SOD2 σε επίπεδο mRNA μεταξύ ασθενών και μαρτύρων

From the "hungry acid" to pepsinogen: a journey through time in quest for the stomach's secretion.

The stomach's secretion has been a mystery for centuries. Even after the first indications of its function and role appeared, every formulated idea on the nature of the gastric liquid remained open to controversy. After the ancient Greek perceptions which identified acids as bitter-sour liquids, the physicians of the Iatrochemical School, under the influence of Paracelsus and the alchemists, were the first to point out the physiologic chemistry of secretion. Experiments on animals and humans during the 17th-18th centuries, which mainly included swallowing various substances and observing the process, enhanced knowledge, with Stevens and Spallanzani playing the leading part. Any existing objections ceased in 1823, when Prout clearly identified hydrochloric acid as the acid agent of the stomach. Later on, the role of pepsin and pepsinogen was also judged to be important in digestion. In addition, the tremendous contribution of French scientists, experienced in the science of nutrition, must not be underestimated. It took centuries of research, and the involvement of many notable figures from many nations and countries, to form modern concepts of gastric secretion

Ludovico Maria Barbieri (1662-1728), the unknown 17th century physician.

During the 17th century, Ludovico Maria Barbieri from Imola, Italy, discussed the requirement of a gas, seemingly oxygen, for living beings to function. On 6 December 1680, he published his only known work 'Spiritus nitro-aerei operations in microcosmo' in which he reviewed the function of oxygen and the apparatus he used based on the use of experiments rather than just theory. The scarcity of information about his life and work has resulted usually in him being a neglected figure in Italy. In this manuscript we uncover the extant information about his life and reveal that he had been a restless spirit and a great example to the 17th century scientific method

A case report of recessive restrictive cardiomyopathy caused by a novel mutation in cardiac troponin I (TNNI3)

Abstract Background Restrictive cardiomyopathy is a rare cardiac disease, for which several genes including TNNT2, MYPN, FLNC and TNNI3 have been associated with its familial form. Case presentation Here we describe a female proband with a severely manifested restrictive phenotype leading to heart transplantation at the age of 41, who was found homozygous for the novel TNNI3 mutation: NM_000363.4:c.586G > C, p.(Asp196His). Her parents were third-degree cousins originating from a small village and although they were found heterozygous for the same variant they displayed no symptoms of the disease. Her older sister who was also found heterozygous was asymptomatic. Her twin sister and her brother who were homozygous for the same variant displayed a restrictive and a hypertrophic phenotype, respectively. Their children are all carriers of the mutation and remain asymptomatic until the age of 21. Conclusion These observations point to a recessive mode of inheritance reported for the first time for this combination of gene/disease

Reduced global longitudinal strain at rest and inadequate blood pressure response during exercise treadmill testing in male heterozygous familial hypercholesterolemia patients

Background: Heterozygous familial hypercholesterolemia (heFH) is a genetic disorder leading to premature coronary artery disease (CAD). We hypothesized that the subclinical pathophysiologic consequences of hypercholesterolemia may be detected before the occurrence of clinically overt CAD by stress testing and myocardial strain imaging. Patients-methods: We evaluated the treadmill tests (ETTs) of 46 heFH men without known arterial hypertension/diabetes mellitus/vasculopathy like CAD and of 39 healthy men matched for age, baseline systolic/diastolic blood pressure (BP) and heart rate (HR), using Bruce protocol. Global longitudinal strain (GLS) of the left ventricle (LV) additionally to ejection fraction was obtained. Results: heFH men reached a significantly higher peak systolic and diastolic BP compared to controls (p = 0.002 and p < 0.001, respectively). Mean rate pressure product was significantly higher in heFH patients (p = 0.038). Both duration of the ETT and workload in metabolic equivalents was lower in the heFH group (p < 0.001 and p < 0.001, respectively). Baseline to peak rise of systolic and diastolic BP in heFH men was higher (p = 0.008 and p < 0.001 for systolic and diastolic BP, respectively). Furthermore, heFH men had higher rise of HR from baseline to peak, compared to controls; (p = 0.047). GLS in heHF men was slightly decreased (p = 0.014), although the ejection fraction was similar in both groups. Conclusion: heFH men have a higher rise in systolic/diastolic BP during ETT, which may reflect early, preclinical hypertension. Furthermore, slight impairment of LV GLS is present, despite the absence of apparent myocardial dysfunction in conventional 2D echocardiography

Data on eNOS T786 and G894T polymorphisms and peripheral blood eNOS mRNA levels in Sickle Cell Disease

In this article, we present data on endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) gene T786C and G894T polymorphisms in Greek steady-state Sickle Cell Disease patients in comparison to healthy controls. Moreover, eNOS mRNA levels were determined in peripheral blood samples from 18 patients and 9 controls. This article complements our recently published article named “Prognostic value of eNOS T786C and G894T polymorphisms in Sickle Cell Disease” (I. Armenis, V. Kalotychou, R. Tzanetea, Z. Kontogeorgiou, D. Anastasopoulou, M. Mantzourani, M. Samarkos, K. Pantos, K. Konstantopoulos, I. Rombos, 2016) [1]